膝关节骨性关节炎(Knee osteoarthritis, KOA)是中老年人群中一种慢性、进行性、退行性骨关节疾病，在全球291种致残疾病中排名第11位。中药已被公认为KOA的补充疗法。芍药苷(Paeoniflorin)是一种单萜苷，是几种治疗OA病变的中药的药理活性成分之一，如疏精活血汤、骨骨消痛胶囊、参金活血合剂。芍药苷的抗关节炎作用有文献报道，在OA中也有报道。然而，芍药苷在关节软骨细胞中的潜在分子机制至今仍未明确。

遗传学和表观遗传学仍然是OA中大量研究的课题，自2016年以来，已发表了数十篇环状rna (circRNAs)研究。已经分析了人OA软骨、滑膜和软骨细胞中circRNA表达谱的改变。在生物学作用方面，环状rna是细胞凋亡、自噬炎症反应和软骨细胞胞外基质的重要调节因子。此外，circRNAs-microRNAs (miRNAs)调控网络被纳入OA的发生和发展过程。circrna和mirna在OA患者外周血或血清中的表达也不同，因此可以作为潜在的诊断生物标志物。源自PREX1基因的CircRNA hsa_circ_0060652(简称circ-PREX1)在OA膝关节软骨细胞中的表达高于大骨节病的表达。

然而，circ-PREX1在OA软骨细胞中的作用及其相关机制尚不清楚。本研究的目的是评估

(1)在白介素(IL)-1β诱导的KOA患者和软骨细胞中circ-PREX1和miR-140-3p的含量，

(2)这两个基因在芍药苷对IL-1β诱导的人软骨细胞损伤的保护作用中的作用和关联。

方法：采用实时荧光定量PCR和western blotting检测circPREX1、microRNA (miR)-140-3p、Wingless-type MMTV整合位点家族、成员5B (WNT5B)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平。MTT法、EdU法、流式细胞术和酶联免疫吸附法分别评估细胞活力、增殖、凋亡和炎症反应。双荧光素酶报告实验和RNA免疫沉淀实验鉴定了circ-PREX1、miR-140-3p和WNT5B之间的关系。

图1:hsa_circ_0060652 (circ-PREX1)和miRNA (miR)-140-3p在膝关节骨关节炎(KOA)患者和白细胞介素(IL)-1β诱导的人软骨细胞中的表达。A‑D RT-qPCR检测(A, C) KOA软骨组织(KOA;n = 30)和对照软骨组织(对照;n = 30)， B、D人正常软骨细胞系(C28/I2)经IL-1β(0、5、10和20 ng/mL)处理24 h。E Pearson相关分析(r)分析KOA软骨中circ-PREX1与miR-140-3p的相关性(n = 30)。F, G RT-qPCR检测il -1β诱导的C28/I2细胞经芍药苷(0、25、50和100 μM)预处理4 h后circ-PREX1和miR-140-3p水平。*P < 0.05

图2 芍药苷对il -1β诱导的体外人软骨细胞的作用。A、B细胞MTT试验评估的可行性C28 / I2细胞对il - 1β(0、5、10、20 ng / mL) 24小时或芍药苷(0、25、50和100μM) 24 h。C - il - 1β全身C28 / I2细胞预处理与芍药苷(50μM) 4 h, C RT-qPCR发现circ-PREX1水平,D细胞MTT试验评估可行性,E EdU试验进行分析细胞增殖,F和G流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡率,bcl - 2 h西方墨点法测量蛋白质含量和伯灵顿,ELISA法测定产物TNF-α和IL-10。* p < 0.05

图3 circ-PREX1对芍药苷对il -1β诱导的体外人软骨细胞保护作用的影响将il -1β诱导的C28/I2细胞预先转染pcDNA-circ-PREX1 (circ-PREX1)或空载体(pcDNA)，然后用芍药苷(50 μM)处理4小时。RT-qPCR检测circ-PREX1水平，B MTT法评估细胞存活率，C EdU法分析细胞增殖情况，D FCM法检测细胞凋亡率，E western blotting法检测Bcl-2和Bax蛋白水平，F ELISA法检测TNF-α和IL-10产物。* p < 0.05

图4 :miR-140-3p对芍药苷对il -1β诱导的体外人软骨细胞保护作用的影响。将il -1β诱导的C28/I2细胞预先转染miR-140-3p抑制剂(anti-miR-140-3p)或阴性对照(anti-miR-NC)，然后用芍药苷(50 μM)处理4小时。RT-qPCR检测miR-140-3p水平，B MTT法评估细胞活性，C EdU法分析细胞增殖，D FCM检测细胞凋亡率，E western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白水平，F ELISA检测TNF-α和IL-10产物。* p < 0.05

图5 circ-PREX1与miR-140-3p的关系。A该图显示了miR-140-3p、circ-PREX1野生型(WT-circ-PREX1)及其突变型(mutc - prex1)之间的推测结合位点。B双荧光素酶报告细胞实验测量携带WT-circ-PREX1或mutc -circ- prex1的报告载体在转染miR-140-3p模拟物(miR-140-3p)或其阴性对照(miR-NC)的C28/I2细胞中的荧光素酶活性。C RNA免疫沉淀(RIP)测定C28/I2细胞中circ-PREX1和miR-140-3p的富集水平。D、E RT-qPCR检测il -1β诱导的C28/I2细胞中circ-PREX1和miR-140-3p的水平，pcDNA、circ-PREX1或siRNA预先转染circ-PREX1或打乱RNA (si-circ-PREX1或si-NC)。* p < 0.05

图6 miR-140-3p靶点的鉴定。A该图显示了miR-140、野生型WNT5B 3'UTR (WT-WNT5B 3'UTR)及其突变体(mutt -WNT5B 3'UTR)之间的推测结合位点。B双荧光素酶报告基因法测定转染miR-140-3p或miR-NC的C28/I2细胞中携带WT-WNT5B 3'UTR或mutt - wnt5b 3'UTR的报告载体的荧光素酶活性。C RIP检测C28/I2细胞中WNT5B和miR-140-3p的富集水平。D - F RT-qPCR和western blotting检测KOA组(n = 30)和对照组(n = 30)以及IL-1β(0、5、10和20 ng/mL)处理24 h的F C28/I2细胞(n = 30)中WNT5B mRNA和蛋白水平。G Pearson相关分析(r)分析KOA软骨中WNT5B mRNA与miR-140-3p的相关性。H, I RT-qPCR和western blotting检测il -1β诱导的C28/I2细胞中预转染anti-miR-NC、anti-miR-140-3p、miR-NC或miR-140-3p的miR-140-3p和WNT5B水平。* p < 0.05

图7 WNT5B对芍药苷对il -1β诱导的体外人软骨细胞保护作用的影响将il -1β诱导的C28/I2细胞在芍药苷(50 μM)处理4小时前，预先转染pcDNA-WNT5B (WNT5B)或pcDNA, Western blotting检测WNT5B蛋白表达水平。B MTT法测定细胞活力。C - EdU法检测细胞增殖情况。流式细胞仪检测细胞凋亡率。E Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白水平。F ELISA法测定产物TNF-α和IL-10。* p < 0.05

图8 芍药苷在体外il -1β诱导的人软骨细胞中调节circ-PREX1/miR-140-3p/WNT5B轴。Western blotting检测il -1β诱导的C28/I2细胞中预转染si-NC、si-circ-PREX1、si-circ-PREX1和anti-miR-NC，或si-circ-PREX1和anti-miR-140-3p的WNT5B蛋白水平。B, C Western blotting检测il -1β诱导的C28/I2细胞中，预转染circ-PREX1、pcDNA、anti-miR-140-3p或anti-miR-NC，然后用芍药苷(50 μM)处理4 h后WNT5B蛋白水平