成体心肌几乎无法再生，心肌受损后易形成纤维化瘢痕，导致心脏功能永久受损，可致心律失常至心衰。缺血性心脏病年致死近千万人，为主要死因。心肌修复涉及复杂细胞与信号调控。有效模拟心肌纤维化重塑，为人源化研究平台提供基础，弥补细胞模型功能不足及动物模型种间差异，对心血管疾病防治尤为关键，尤其在当前病患增长背景下。

2024年9月12日，湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室的张冬卉教授团队与上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心张浩教授团队在Nature Communications上发表题为“Engineered model of heart tissue repair for exploring fibrotic processes and therapeutic interventions”的研究论文。该研究开发了一种可体外再现心肌损伤后阶段性重塑进程并产生功能性障碍结果的工程化人源心肌损伤修复类器官模型，通过单细胞转录组学分析鉴定了心肌损伤修复过程中的以心肌细胞与心脏成纤维细胞为代表的细胞命运转变与关键信号调控。随后，该研究在“迷你”心肌损伤修复模型中批量评价了17种信号通路调节剂的干预作用，最终筛选得到ROCK抑制剂Y27632、WNT激活剂CHIR99021、TGFβ抑制剂SB431542可有效抑制心脏成纤维细胞活化并促进心肌细胞的原位修复。更重要的是，在人源心肌损伤修复模型与心梗小鼠模型上，进一步验证了Y27632/CHIR99021/SB431542依据重塑进展的阶段性干预策略具备更佳的促损伤心肌功能性再生的效果，进而为损伤心肌的治疗策略开发提供了新的参考。

在先前的研究中(Donghui Zhang, et al. Biomaterials, 2013; Donghui Zhang, et al. Nature Reviews Cardiology, 2018)，张冬卉教授结合人多能干细胞来源的心脏谱系细胞与纤维蛋白原水凝胶体系开发了一种可体外复现成体心肌结构与功能特征的心肌组织片，称为人源工程化心肌组织(human engineered heart tissue, hEHT)。在此基础上，本研究设计可标准化损伤的人心脏类器官损伤-修复模型，发现心脏成纤维细胞，而非心肌细胞，主导了自修复进程，进而产生了以心脏成纤维细胞、Ⅰ型胶原、纤连蛋白为主体的纤维化瘢痕区域(图1)。

图1. 工程化人源心脏类器官的损伤与纤维化修复

利用光标测技术(optical mapping)，研究团队进一步表征了由纤维化瘢痕引发的hEHT以钙信号传导紊乱与钙活动衰减为特征的功能失调(图2)，这种失调严重时甚至会引发重塑hEHT发生全局性的“钙回旋”(reentry)，这些现象与大鼠心梗后的电生理功能异常特征一致。由此本研究开发了一种可体外复现损伤起始、纤维化发展与最终诱发功能失调的工程化人源心肌损伤修复类器官模型。

图2. 纤维化瘢痕引发的区域性钙信号传导阻滞

为阐述损伤心肌修复过程中的细胞命运转化与关键信号调控，研究团队对处于自修复早期与晚期阶段的损伤hEHT分别进行了单细胞转录组测序。分析结果表明，hEHT中存在心肌细胞、心脏成纤维细胞、内皮祖细胞、心外膜细胞4种主要细胞类群，心肌细胞与成纤维细胞又可进一步分辨为不同亚群(图3)。冷冻损伤激活了早期心肌细胞，尤其是非成熟心肌细胞亚群的缺氧应激反应和随后的代谢转变。而心脏成纤维细胞作为心肌病理性重塑的主要贡献者，损伤增强了其向肌成纤维细胞的转化与细胞外基质分泌能力。伪时序分析进一步描绘了上皮样成纤维细胞(VIM⁺/CD44⁺/CXADR⁺)向过渡态(VIM⁺/CD44⁺/CXADR^-)演化，进而转变为活跃态成纤维细胞(VIM⁺/CD44^-/CXADR^-, αSMA⁺)的细胞命运。免疫荧光结果验证了上述心脏成纤维细胞亚群在非损伤区与重塑区的空间异质性，同样也发现心外膜细胞(WT1⁺)对于重塑的贡献，暗示上述细胞亚群在心肌病理性重塑进程中的命运联系，以及CD44对于心脏成纤维细胞命运转变的指示作用。

图3. 人源工程化心脏类器官中的心肌细胞、成纤维细胞亚群组成

鉴于上述心肌损伤修复进程所涉及的调控信号多样，主要涉及到ROCK、WNT、TGFβ、cAMP、PI3K、ERK、NFκB、前列腺素E2、成纤维细胞生长因子共9种信号。为评估上述信号的激活与抑制对于修复进程的影响，研究团队开发了一种“迷你”版本的人源心肌损伤修复模型(图4)，在保证心肌应激-纤维化重塑特征的同时，实现了对上述9种信号共17种调节剂的批量评估，最终从中筛选得到ROCK抑制剂Y27632、WNT激活剂CHIR99021、TGFβ抑制剂具备良好的抗纤维化/促心肌原位修复作用。

图4.“迷你”人源心肌损伤修复模型

为系统性评估Y27632/CHIR99021/TGFβ对hEHT异常电生理功能的回补作用，研究团队开发了包含9种钙活动特征指标的评分体系，鉴定出Y27632/CHIR99021/TGFβ依据重塑进程的阶段性组合干预，相较于单因素处理能更好的促进瘢痕区域内的异常钙活动恢复到正常水平。这种阶段性组合干预的优越性可能得益于Y27632早期抗凋亡、CHIR99021促心肌细胞增殖以及SB431542晚期抗纤维化的复合作用。新生小鼠冷冻损伤模型与成年小鼠心梗模型进一步验证了Y27632/CHIR99021/TGFβ的阶段性组合，相较于阶段性单因素处理能发挥更理想的抗心肌纤维化、促心肌功能性再生的效果。由此，本团队基于人心脏类器官损伤-修复模型，描绘心肌病理性重塑进程与信号调控，并设计依据病程发展的阶段，进行阶段性信号调控策略，为心肌损伤治疗方案的开发提供有价值的参考。同时，本模型的构建成功，也预示着人心脏类器官研究在向着功能化、定量化、临床表型对应化的方向发展(图5)。

图5. 人源心肌损伤修复模型用于治疗策略开发

湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室为本文的第一通讯单位，湖北大学生命科学学院2019级博士研究生杨鹏程与武汉大学医学研究院2023级博士研究生朱利航(原湖北大学生命科学学院2020级硕士研究生)为本文的共同第一作者，湖北大学生命科学学院张冬卉教授、蔡琳副教授、上海儿童医学中心张浩教授为本文的共同通讯作者。此外，本研究还得到了湖北大学生命科学学院Jonathan Nimal Selvaraj助理教授、2023级硕士研究生王诗雅、李子龙同学、上海儿童医学中心叶霖财副教授、四川大学华西第二医院张曜耀教授、陈涵笑博士、斯高电生理研究院王功新研究员、北京极客基因科技有限公司宋婉君女士以及波士顿儿童医院William T Pu教授的帮助和支持。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-024-52221-9