导读

据世界卫生组织调查数据显示，2021年全球约有500万儿童在5岁前死亡，其中46%发生在出生后第一个月内，即新生儿时期。传统上，儿童死亡原因（CoD）模型主要基于死因推断和生命登记数据构建，其将死亡仅归因于单一的潜在疾病，导致很难确定真正的死亡原因。近年来，人们发现通过死后微创组织采样（MITS）可对儿童死亡原因进行深入了解。将MITS和其他信息结合能够更详细地描述新生儿死亡原因，包括确定导致死亡的前因、直接事件以及潜在的死亡原因。

目前，常用的检测方法（包括传统的培养方法和核酸扩增试验），已被证明不足以发现感染性死亡病例中的病原体。新一代宏基因组测序（mNGS）能够解决上述难题，其不基于预先选定的目标，能够无偏倚识别病毒、细菌、真菌，可为不同病原体在死亡因果途径中的作用提供更精细的理解。此外，mNGS还可以进行非培养的抗微生物药物耐药性分析，从而可以对样本中存在的抗微生物耐药基因进行表征。

近日，南非威特沃特斯兰德大学的研究人员在Nature Communications发表了题为“Metagenomic sequencing of post-mortem tissue samples for the identification of pathogens associated with neonatal deaths”的文章。研究团队评估了mNGS在识别与新生儿死亡相关的病原体方面的效用，使用其检测了由MITS收集的南非索韦托新生儿死后的血液和肺组织样本。在90%的死者中，mNGS结果与传统的培养方法和对死后样本的核酸扩增检测（NAAT）结果相吻合，可检测出导致死亡的病原体。此外，通过mNGS还能够确定所有病原菌的耐药谱，并鉴定出许多多重耐药菌。总而言之，mNGS能够在死后血液和组织样本中成功识别导致感染相关死亡的病原体。

文章发表在Nature Communications

主要研究内容

研究团队共纳入236例符合条件的死亡新生儿，并对其中153例进行MITS，其潜在CoD包括早产并发症（53%）、产时事件并发症（15%）和先天性畸形（13%），有88例与直接或潜在的感染病原因相关。在非感染性疾病死者中，共纳入16例作为对照；在感染致死患者中，31例有剩余的肺组织和血液样本可用于mNGS分析，其中，20例可通过常规的生前或死后培养或NAAT（仅死后样本）鉴定出病原体。

基于mNGS测序reads的平均总数或非宿主reads（未映射到人类基因组的reads）的平均百分比，研究团队发现，与感染性CoD病例相比，对照组死者的非宿主reads百分比较低。在上述20例能够被鉴定的病例中，mNGS在18例（90%）中鉴定出了相同的病原体。此外，mNGS还发现了其他可能导致新生儿死亡的微生物，即产气克雷伯氏菌。

在11例死亡归因于感染的病例中，前期并未通过常规方法发现病原体，但使用mNGS能够在9例死者中发现潜在的病原体；仅通过mNGS便能确定的假定病原体包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和粘质链球菌。此外，在14例死前血液培养呈阳性的病例中，mNGS在86%病例中检测到相同的微生物。

图1. mNGS测序序列比对到宿主或非宿主基因组的比例。来源：Nature Communications

研究团队对mNGS RNA文库中原始的paired-end reads进行筛选，以寻找抗生素耐药性（AMR）基因。结果显示，在mNGS数据中共鉴定出32个AMR基因，包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、磺酰胺类等的耐药基因。β-内酰胺酶编码基因显示出最大的多样性，共鉴定出12个独特的β-内酰胺酶基因突变，以NDM-1基因突变最为常见。

AMR基因丰度的总体比较显示，与未鉴定出病原体的感染性死亡病例相比，确定病原体为CoD的病例具有更多的AMR基因。

图2. 基于RNA文库进行AMR基因鉴定。来源：Nature Communications

研究团队为12例确定病原体的病例和6例未确定病原体的病例制备了DNA文库。在已知病原体的病例中，DNA文库能够识别假定的病原体；在6个病例中，通过培养或NAAT确定了感染相关微生物，均为鲍曼不动杆菌。研究团队进一步分析了上述6个鲍曼不动杆菌阳性样本，并生成了完整的基因组序列（92%-99%），这些样本均为密切相关的ST1型。在6例未发现病原体的病例中，DNA文库鉴定出1例肺炎克雷伯菌。

图3. 鲍曼不动杆菌基因组的全基因组系统发育树。来源：Nature Communications

接下来，研究团队对检测到微生物的DNA文库中原始paired-end reads进行筛选，以确定是否存在AMR标记。与RNA文库相似，共鉴定出29个AMR基因，其对β -内酰胺类、氨基糖苷类、磺酰胺类等显示出耐药性。此外，β-内酰胺酶和氨基糖苷编码基因显示出最大多样性，各有9个基因。

图4. 基于DNA文库进行AMR基因鉴定。来源：Nature Communications

结 语

综上所述，研究团队评估了mNGS在新生儿肺炎、脓毒症和脑膜炎死亡中识别病原体的临床应用，发现mNGS能够确定90%死者的致命病原体。该研究数据表明，使用死后MITS采集样本的临床宏基因组NGS，可能有助于确定新生儿死亡的特异性病原感染原因，这种诊断方法可指导新生儿重症监护病房未来的治疗计划，帮助确定新发感染和疾病表型，以及确定和帮助控制医院感染暴发。

此外，在资源有限的国家/地区，mNGS还可用于确定特定疾病的病原体状况和存在的最常见的抗微生物药物耐药性基因，从而指导靶向药物的开发。

参考文献

Baillie, V.L., Madhi, S.A., Ahyong, V. et al. Metagenomic sequencing of post-mortem tissue samples for the identification of pathogens associated with neonatal deaths. Nat Commun 14, 5373 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40958-8