串联重复是基因组的常见结构变异，对遗传疾病和癌症起着重要作用；但解释串联重复的表型后果仍然具有挑战性，部分原因是缺乏模拟此类变异的遗传工具。基于CRISPR/Cas9缺口酶和逆转录酶的先导编辑器，能够实现单个碱基和小片段进行精确的编辑，包括所有12种碱基替换、插入和缺失；也能实现大片段的删除和置换而无需双链断裂或提供模板。然而，还未有编辑工具能够实现大片段基因组序列的扩增。

2023年6月9日，四川大学姚少华团队在Genome Research 在线发表题为“Targeted， programmable， and precise tandem duplication in the mammalian genome”的研究论文，开发了一种基因扩增编辑的策略（TD-PE），实现了在哺乳动物基因组中定点、可编程和精确的串联扩增。在这种策略中，每个目标串联重复设计一对先导编辑引导RNA（pegRNA），它们编码相同的编辑序列，但在相反的方向上启动单链DNA（ssDNA）的延伸。每个延伸的逆转录酶模板（RT）与另一个pegRNA的目标区域设计同源，以促进编辑后的DNA链重新结合和两者之间片段的扩增。

该研究证明了TD-PE可以产生范围从50个碱基对到10 kb的基因组片段的稳定且精确的原位串联扩增，最大效率高达28.33%。通过精细调节pegRNA，可以同时实现序列扩增和插入，增加了TD-PE编辑方案的灵活性。此外，该研究应用TD-PE制备了多种与疾病相关的串联重复，证明TD-PE在遗传学研究中应用前景。

基因组区域的串联重复（TD）是遗传进化的主要推动力，并在人类疾病的发展中起着重要作用，包括遗传疾病和癌症。许多这些重复片段的大小超过100个碱基对，导致基因组的结构变异，进而导致特定基因的扩增、基因表达的失调或获得新的基因功能。尽管它们的重要性，模拟TD仍然具有困难，并且TD在病理变化中的贡献程度在许多事件中尚不清楚。

最近开发的基因编辑技术，特别是基于CRISPR-Cas9系统的技术，可以实现多种基因编辑方案，为基础生物医学研究和临床转化提供了强大的工具。特别是，先导编辑（PE）工具能够以精确和多功能的方式靶向编辑小型基因片段，而不会引起大量的双链断裂（DSB），从而最小化非预期的插入和缺失（indel）。PE系统包含两个组成部分，即Cas9 nickase和逆转录酶（RT）融合蛋白以及主编辑引导RNA（pegRNA）。在pegRNA的指导下，RT在非靶向链（NTS）的切割位点的3'端编写特定信息，然后通过内源性DNA修复或复制机制将其整合到基因组中。目前，PE在各种应用中显示出巨大的潜力，包括小片段indels、单核苷酸转换和大片段缺失，但还不能实现片段扩增。

该研究开发了一种新颖的PE策略，即TD-PE，通过使用一对方向相反的in-trans pegRNA，在哺乳动物基因组中产生大型DNA片段的串联重复。这些pegRNA诱导从目标区域单链DNA外向延伸，并且延伸的单链DNA及其边界序列被设计成互补的，以促进同源搜索过程并引导DNA修复倾向于目标区域的扩增。该研究证明，TD-PE在内源基因组位点中产生了稳定且精确的DNA大片段的原位扩增，基因扩增长度范围从50个碱基对到10 kb，且精确性较高，只有低水平的非目的编辑。

此外，应用高通量测序该研究还发现TD-PE可以造成目的片段的多次扩增；这可能是由于TD-PE没有破坏Cas9的结合未定从而引起TD-PE对目标区域的多轮作用造成的。该研究还通过精细调节TD-PE，制备了多种与疾病相关的串联重复扩增，展示了其在遗传学研究中应用潜力。

该研究由四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室完成，姚少华教授为本论文通讯作者，焦瑶歌博士、黎敏硕士、何星雨硕士、王燕红博士为共同第一作者。姚少华研究团队长期致力于基因编辑和基因治疗研究，开发致病位点特异的基因编辑工具和基于基因编辑技术的遗传性疾病治疗方案。

原始出处：

Yaoge Jiao， et al. Targeted， programmable， and precise tandem duplication in the mammalian genome. Genome Res. 2023.