韩秀鑫教授组稿｜张坤生：单细胞测序技术在骨肉瘤中的应用
时间：2024-09-01 06:00:59 热度：37.1℃ 作者：网络
编者按：骨肉瘤是来源于间叶组织的原发恶性骨肿瘤，好发于长骨干骺端，约占全部骨肿瘤的15%[1]，其恶性程度高，易发生耐药和转移，预后差，针对骨肉瘤目前仍缺乏有效的治疗策略[2]。
本期「专家组稿」由天津医科大学肿瘤医院韩秀鑫教授担任执行主编，与天津医科大学肿瘤医院博士研究生张坤生共同分享《单细胞测序技术在骨肉瘤中的应用》，为医者和患者提供更多参考。
近年来，肿瘤组织的异质性被证明是影响肿瘤进展和治疗效果的重要因素，骨肉瘤作为一种高度恶性的肿瘤，表现出极为显著的异质性，这可能是骨肉瘤预后差的主要原因[3,4]。传统的转录组学是基于混合细胞的转录本进行分析，在识别特定类型细胞方面分辨率较低，往往难以探索肿瘤细胞的异质性，随着技术的不断发展，单细胞测序技术得到了广泛的应用[5]，单细胞测序已被证实能够以更高的分辨率为解析疾病发生、发展的机制提供线索[6]。对于肿瘤等高度异质性的疾病，单细胞测序具有极大的应用前景，目前已在包括肝癌、胃癌、结直肠癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤中得到了应用，加深了对肿瘤发生发展、免疫浸润、化疗抵抗等机制的理解和认识[7-10]。在骨肉瘤研究领域，单细胞测序技术也逐渐引起了重视，多用于鉴定和分类肿瘤细胞、揭示肿瘤细胞的异质性、解析肿瘤微环境，研究骨肉瘤发生发展的机制并尝试探寻新靶点。本文重点陈述借助单细胞测序解析肿瘤细胞异质性及肿瘤微环境的异质性。
一、成骨性和成软骨细胞
成骨性和成软骨细胞是临床上促成常规骨肉瘤的主要细胞类型。Zhou等[4]鉴定了恶性成骨性细胞的六个亚簇。不同亚簇存在明显的异质性，亚簇1和亚簇2对应于增殖性成骨细胞簇，共表达成骨细胞标志物COL1A1、RUNX2、COL3A1和增殖性细胞标志物TOP2A、PCNA和MKI67等，亚簇3与血管生成和IFN-a和IFN-y信号通路相关。亚簇4富集于MYC和氧化磷酸化信号通路。亚簇5参与TGF-B、P53、KRAS和缺氧信号通路。亚簇6与肌生成、炎症反应和同种异体移植排斥信号通路有关。
Zhou等[4]还鉴别出了四个成软骨细胞亚簇，分别对应的是增殖性成软骨细胞簇、两个肥大性成软骨细胞亚簇和成软骨细胞向成骨细胞分化的一个亚簇。Liu等[11]鉴定了5个成骨细胞OS亚群（分别命名为C1-C5），它们在原发性骨肉瘤患者中具有不同的功能。C1与炎症有关，而C2与细胞周期和细胞增殖有关。C3参与碳水化合物跨膜转运蛋白活性和葡萄糖分解代谢过程。C4在响应ECM过程和蛋白质进入过氧化物酶体基质的过程中富集。C5参与替代骨化、骨小梁形态发生和骨小梁形成。此外，还发现成骨细胞通过核因子Kb配体受体激活剂调节骨溶解。成骨性骨肉瘤细胞也通过血管内皮生长因子-a调节血管生成。特别是高水平的C1/C5成骨性骨肉瘤细胞与预后不良有关，这表明它们在可能的治疗用途方面可能比其它细胞类型具有更高的临床价值[11]。
二、破骨细胞
破骨细胞被认为在骨溶解和肿瘤生长中起重要作用[12]。破骨细胞是人体中唯一已知能促进骨吸收的细胞，其通过分泌有机酸，转移钙离子或分泌相关蛋白水解酶促进骨吸收。
Liu等[11]报道的研究结果确定了四个破骨细胞亚群，包括祖破骨细胞、成熟破骨细胞、功能低下破骨细胞和非功能破骨细胞，并揭示了破骨细胞的分化和功能是由成骨性骨肉瘤细胞通过TNFSF11-TNFRSF11A相互作用调节的。
Zhou等[4]检测到三个破骨细胞亚簇。祖破骨细胞与刺激成骨有关，而未成熟破骨细胞和成熟破骨细胞在晚期骨肉瘤中发挥重要作用。然而，成熟破骨细胞在成软骨性骨肉瘤肺转移和复发病变中的比例低于原发性骨肉瘤病变，这意味着破骨细胞的状态可能取决于骨肉瘤病变趋于成骨性趋化信号强度。
三、癌症相关成纤维细胞
癌症相关成纤维细胞可以刺激肿瘤的进展、生长和转移，被认为是肿瘤微环境的重要组成部分[15]。
已经被识别出的包含多种亚型，不同亚型往往具有不同的功能状态，如mCAFs往往被认为与肿瘤血管生成有关，代谢上表现出高脂肪酸合成活性；而iCAFs又叫炎性CAFs，有文章报道其亚型与血管生成有关，与EMT有关，在促进肿瘤细胞增殖，促进免疫抑制性微环境的建立过程中发挥重要作用，其可能通过旁分泌抑制CD8+T细胞活性；meCAFs则表现出与代谢有很强的相关性，尤其是糖酵解丙酮酸代谢在该细胞中显著富；pericytes又称周细胞是一种重要的iCAFs来源，在其过程中，多种通路被激活，包括EMT、细黏附调节、血管生成，pCAFs则表达细胞周期相关基因，有文献报道部pAFs有一定增殖特性[16]。
Zhou等人[4]在骨肉瘤中也确定了癌症相关成纤维细胞的三个亚簇，包括COL14A1+基质成纤维细胞、DES+COL14A1-和MYL9+LUM+成纤维细胞，其中DES+COL14A1-纤维细胞可能是平滑肌样细胞，而MYL9+LUM+成纤维细胞与肌成纤维细胞相似，这三个细胞亚型中均高表达成骨细胞系标志物IBSP和SPP1，这表明其可能具有成骨细胞样功能。
COL14A1+基质成纤维细胞和MYL9+LUM+成纤维细胞主要见于原发和复发性病变，而DES+COL14A1成纤维细胞主要见于肺转移性病变。Liu等11也在骨肉瘤中发现了癌症相关成纤维细胞的3个亚簇（C1-C3）。C1与血管重塑、血管发育和血管直径大小有关。C2参与成骨细胞的增殖、发育和骨化。C3与细胞周期和细胞增殖有关。
四、免疫细胞
免疫细胞，如巨噬细胞、B细胞和T细胞，对骨肉瘤的治疗也有很大的帮助。
巨噬细胞 肿瘤相关巨噬细胞可能与OS进展有关，因为在肺转移性OS病变中检测到占据主导地位M3型肿瘤相关巨噬细胞也就是FABP4+巨噬细胞[4]。此外其还识别出显著富集IFN-α、IFN-y、IL2/STAT5、IL6/JAK/STAT3的M1肿瘤相关巨噬细胞和经典具备抗炎属性的M2型肿瘤相关巨噬细胞，不仅如此，在M2型巨噬细胞中检测到了M1型巨噬细胞标记基因的高表达，这表明二者之间可能存在一定的转化[4]。Liu等[11]进行的一项研究发现巨噬细胞有五种亚型。FABP5+巨噬细胞与脂质代谢有关，而TXNIP+巨噬细胞与M2巨噬细胞相似。与M1极化相关的FIT1+巨噬细胞调节调节性T细胞并参与CD8+T细胞衰竭，说明针对CD8+T细胞和巨噬细胞的免疫治疗可能有效。MKI67+巨噬细胞可能是具有增殖能力的组织驻留细胞。
B细胞 Zhang[12]等人对15个OS患者胸腔积液样本进行了单细胞RNA测序，用于探索肿瘤微环境，该研究主要发现了四个主要B细胞亚群（原始B细胞、调节性B细胞、浆细胞和新型CLEC11A+B细胞），其中，CLEC11A + B细胞显著高表达SPP1、CLEC11A和MMP931基因，认为其可能参与骨代谢，KEGG富集分析该细胞亚群过度表达的基因发现其与细胞外基质（ECM）发生相互作用，并与蛋白质消化吸收、矿物质吸收和雌激素信号通路有关，这可能与骨肉瘤的增殖转移有关，调节性B细胞显著表达CD82、CD70、CD27，CD79A、CD44、HLA-DPB1和HLA-DPA1等免疫调节基因，富集分析表明该类细胞具有增强的抗原处理和呈递活性、吞噬体、B细胞受体、NF-κB、C型凝集素受体与血小板激活信号通路活性。不仅如此，CLEC11A+B细胞被发现主要存在于原发性肿瘤组织中，而调节性B细胞更多见于恶性胸腔积液中，配受体互作分析表明，CLEC11A + B细胞可以通过调节肿瘤细胞、破骨细胞或T细胞亚群在骨肉瘤中的活动来影响骨肉瘤的进展。
T细胞 是癌症免疫治疗的重要组成部分，但它们在细胞类型、基因表达模式和功能特征方面的异质性对T细胞免疫治疗的反应有显著影响[17]。Zhou等发现通过细胞分群识别出了CD8-CD4-T、CD8+T、CD4+T、Treg、增殖T和NKT细胞等免疫细胞亚型[4]，在复发和转移性OS病变中CD4+和CD8+T细胞的百分比低于原发病变，这可能表明以T细胞为基础的免疫治疗无效。Liu等[11]发现IFIT1+巨噬细胞通过趋化因子配体受体与耗竭的T细胞和treg相互作用。这些细胞可能适用于OS的免疫治疗。
五、肿瘤干细胞
肿瘤干细胞（Cancer stem cell,CSC）参与肿瘤发生发展的关键步骤，包括肿瘤起始、增殖、侵袭、转移、耐药以及复发。Zhang等人[13]对通过9个松质骨样本和6例常规OS的单细胞测序数据进行整合分析，鉴定出了7个骨肉瘤细胞亚簇，其中一个被命名为CSC-like骨肉瘤细胞，对该细胞簇再分群表征了4个细胞亚簇，分别是PTTG1_CSC、SERPINA1_CSCL1、FUS_CSCL2和SPP1_CSCL3，随后通过对OS干细胞的鉴定与表征，认为SERPINA1_CSCL1、FUS_CSCL2和SPP1_CSCL3可能是OS细胞来源，这可能为骨肉瘤干细胞疗法提供新的靶点。
六、抗TIGIT治疗前景
最近，抗TIGIT治疗作为检查点疗法引起了越来越多的兴趣，因为它们可以调节CD8+T、Treg和NK细胞的活性[18-21]。TIGIT在OS患者的Treg、CD8+T、CD4+T和NKT细胞中高表达，提示TIGIT抑制剂治疗可能对OS患者有益。Zhou等[4]还利用TIGIT阻断抗体证实了CD3+T淋巴细胞对OS细胞的细胞毒性，为TIGIT抑制可能是未来OS的可行治疗策略提供了初步证据。
Qin等[22]通过bulk数据筛选出ATG16L1可能是骨肉瘤预后相关的关键基因，并借助单细胞测序筛选到了ATG16L1+CD8+T细胞群体，在ATG16L1高表达样本中伴随着CD8+T细胞的低浸润，同时还发现ATG16L1会促进ITGA1的表达并抑制GZMB的表达水平。既往研究表明ITGA1上调与肿瘤进展成正相关[23,24]。这些发现表明，ATG16L1可能是OS的预后生物标志物和治疗靶点。
主编点评
单细胞测序以其极高的分辨率实现对单个细胞的深度解析，通过对单个细胞的高通量测序能够了解细胞的基因表达及变异情况，帮助深度理解肿瘤的异质性。对于异质性非常强的骨肉瘤而言，借助单细胞测序技术能够深入了解骨肉瘤中不同细胞亚型的特征和表达谱，同时又能帮助探索不同细胞亚型的相互作用，揭示骨肉瘤发生、发展和转移过程中潜在的调控机制和关键信号通路。单细胞测序还能为新的治疗靶点的开发提供理论支撑，并通过对各个细胞亚型特征的解析，为个体化治疗方案的设计提供依据。
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