胚胎植入前遗传学检测（PGT）是辅助生殖与遗传学检测技术相结合的一种胚胎诊断检测技术，在移植前筛查胚胎染色体以排除染色体异常的胚胎。但是由于目前该技术复杂昂贵，且有创操作可能存在安全风险，所以该技术在临床的应用受到一定限制。因此，人们开始探索利用囊胚腔液和胚胎培养液中发现的游离DNA进行无创PGT。作为更加安全和便捷的基因检测技术，目前无创PGT已经在胚胎染色体检测等方面取得了一定进展，但现有的研究结果之间差异较大，临床应用的有效性仍存在争议。本文就游离DNA的来源及产生机制、无创PGT的临床研究现状进行综述，为无创PGT应用于临床实践提供参考。

当前，不孕不育已成为我国乃至全球范围内突出的公共卫生问题，受不孕不育症影响的育龄夫妇比例在10%~18%之间。辅助生殖技术对解决不孕不育问题起着较为关键的作用，胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）作为辅助生殖与遗传学检测技术相结合的一种胚胎诊断检测技术，能够在移植前筛查胚胎染色体以排除染色体异常的胚胎，用于改善辅助生殖助孕效果。

根据不同的临床目的，PGT技术分为胚胎植入前非整倍体筛查（preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A）、胚胎植入前单基因遗传学检测（preimplantation genetic testing for monogenic/single gene disorders，PGT-M）和胚胎植入前染色体结构重排检测（preimplantation genetic testing for chromosomal structural rearrangements，PGT-SR）。

常规PGT技术在显微操作水平为有创检查，在胚胎安全性方面缺乏足够可靠的评估，且当前临床应用最为广泛的囊胚活检需要购买和维护专业设备，进行专业的人员技术培训，成本较高。与之相比，无创PGT(non-invasive PGT, niPGT)能够避免胚胎活检过程中的潜在风险，通过检测胚胎发育过程中释放的游离DNA(cell-free DNA, cfDNA)片段来评估胚胎质量以判断胚胎是否符合移植条件，但其结果的准确性受到诸多因素的影响。

本文概述了近年来cfDNA等在niPGT当中的研究进展与niPGT在临床研究方面的现状，对优化niPGT研究结果的方式进行总结，为niPGT技术的进一步研究提供参考。

一、cfDNA的来源与产生机制探索

cfDNA分子是niPGT技术分析的主要生物学标志物之一，它的溯源研究已经取得了一定进展，但其产生机制仍有待明确。

Vera-Rodriguez等进行了一项旨在解释cfDNA来源的研究，他们揭示了胚胎培养后培养基中cfDNA的增加，从而确认cfDNA是胚胎在体外发育过程中释放到胚胎培养液里的。Leaver等认为cfDNA是胚胎在分裂和发育过程中发生细胞坏死或凋亡，胚胎内源性DNA被降解并渗透到胚胎培养液中的结果。Winiarczyk等通过研究小鼠胚胎，发现内细胞团细胞凋亡比例比囊胚滋养外胚层细胞要高。Huang等的实验发现人类胚胎cfDNA可能来自胚胎发育过程中滋养外胚层和内细胞团的细胞凋亡，且内细胞团细胞发生凋亡的比例大于滋养外胚层细胞，凋亡的整倍体细胞数量远多于非整倍体细胞，意味着cfDNA将比传统滋养外胚层细胞活检提供的胚胎遗传状况相关信息更完整，这对niPGT-A的研究具有重要意义。

但是，Gleicher等对Huang等的结果存在质疑，他们认为滋养外胚层细胞与胚胎培养基直接接触，且相比内细胞团占细胞质量的比例更大，因此cfDNA主要来自于滋养外胚层细胞，并且胚胎在发育过程中具有自我校正机制，原来的非整倍体胚胎在后期可发育成整倍体，故cfDNA检测无法明确胚胎的真实核型，反而可能增加非整倍体假阳性诊断的风险。就目前而言，胚胎cfDNA主要来自胚胎细胞凋亡的这一点基本可以确定，除此之外，cfDNA释放的具体过程，每种DNA所代表的胚胎遗传学状态等问题都仍在探索之中，尚未有统一的结论。

在cfDNA来源和产生机制的探索过程中存在的最大阻碍是母体遗传物质的污染，Vera-Rodriguez等的研究中有86%～94%的样本都受到了母源DNA的污染。在Capalbo等和Xie等的研究中也同样提及了母源DNA污染问题， 并提出母源污染率对niPGT的成功率具有显著影响。

Chen等利用DNA甲基化方法追溯胚胎培养液中cfDNA的来源，对194例体外培养胚胎培养液进行全基因组DNA甲基化测序：为减少母源污染，该研究使用了单精子注射技术并进行了颗粒细胞剥除，但结果显示培养液中cfDNA的来源仍然包括颗粒细胞和极体细胞；作者同时计算了胚胎培养液cfDNA中几种细胞来源的比例，发现有将近1/3的样本存在严重的母源DNA污染，12%的cfDNA样本几乎仅来自于颗粒细胞，4%的样本仅来自于极体细胞。这表明有效区分母源DNA与胚胎源DNA、排除污染是cfDNA检测临床应用的重要前提，只有胚胎源性的cfDNA才能够反映真实的胚胎状态。

二、niPGT-A的临床研究现状

常规PGT-A一般是在移植前对具有遗传风险的胚胎进行卵裂球活检、极体活检或囊胚滋养外胚层细胞活检等有创操作获得样本，再利用定量PCR、荧光原位杂交、阵列比较基因组杂交、高通量测序等技术筛选出整倍体胚胎移植入宫腔，从而提高妊娠成功率。

而niPGT-A则是以囊胚腔液检测和胚胎培养液检测来代替传统的有创操作。囊胚腔液检测是使用单精子注射移液管穿刺囊胚内细胞团对侧的囊胚腔，抽吸囊胚腔液使胚胎皱缩，这一技术并非完全无创，但从理论上讲，囊胚腔液的去除对胚胎无害，因为在常规冷冻前，为了提高胚胎冻融后的复苏率，会去除囊胚腔液。胚胎培养液检测是在胚胎体外培养过程中，收集被更换的培养基，通过检测遗传物质和代谢物质来评估胚胎发育潜能，是完全无创性。

1.胚胎培养液检测：利用胚胎培养液中的cfDNA样本开展的niPGT-A是目前niPGT研究最为集中的领域，主要是由于胚胎培养液中的cfDNA含量相对较高，是开展niPGT检测的良好材料来源。

Sialakouma等发现niPGT-A与囊胚活检检测结果相比，两者总体一致性为81.80%、非整倍体一致性为91.66%、整倍体符合性为76.19%。Rubio等报告了niPGT-A与囊胚活检在倍性和性别检测上的一致性达到78.7%、敏感度达到94.5%，同时，该研究发现niPGT-A检测到的非整倍体胚胎流产率升高，这可能说明niPGT-A具有提示临床流产风险的作用。

2020年，Franco等首次报告了基于niPGT-A技术的分娩案例，研究人员先通过形态学评分选择了具有移植潜力的胚胎，之后未经过囊胚活检，而是参考了经胚胎培养液检测的niPGT-A分析结果，完成了胚胎移植，最终成功分娩，该项目研究者认为niPGT-A有望提高筛选胚胎染色体异常的准确性并作为胚胎遗传学检测的手段，但其属于临床个案报道，其结论的正确性尚需进一步验证。因此，一些研究团队正在开展多中心随机对照临床实验，以期为无创胚胎植入前检测对胚胎移植临床结果的影响提供临床证据。

虽然现有研究已在一定程度上验证了niPGT-A可有效改善临床妊娠结局，但许多研究都因为样本数量受限而欠缺足够的说服力，同时niPGT-A的准确性也受到不同实验条件的干扰。Ho等在2018年的研究中分析了41个冷冻保存的胚胎，与囊胚活检相比较，第3天的胚胎培养液中cfDNA的倍性和性别一致性分别为56.3%和81.3%，而第5天则分别为45.5%和78.8%。这些比率远低于前文所述的研究中报告的数据，对于临床应用niPGT-A检测要求来说相距甚远。

Hanson等对104枚胚胎同时进行了囊胚滋养层活检和经胚胎培养液检测的niPGT-A，结果显示，有42枚胚胎出现了niPGT-A与囊胚活检全染色体不一致的现象。这一问题的出现可能有以下两个原因：第一，胚胎嵌合现象的影响。胚胎嵌合是指植入前的胚胎包含有两种或两种以上染色体核型不同的细胞系，它们彼此耐受而不产生排斥反应。Vera-Rodriguez 等在其研究中发现91.7%的胚胎为嵌合体，由于嵌合胚胎的自我修复机制，胚胎培养液中包含凋亡细胞释放的异常cfDNA，这会提高假阳性的概率，可能导致两种检测方法结果不一致。第二，潜在的遗传污染。cfDNA来源较为复杂，即使添加空白培养液作为对照，也不能完全排除母源颗粒细胞的污染。

Hammond等在其开展的一项研究中发现母源DNA污染会导致培养液检测的性别比失衡，在理论性别比为50%的条件下，却只有20%的培养液检测到了Y染色体。这为niPGT-A的临床研究和应用带来了不小的障碍，故目前有部分学者倾向于将niPGT-A作为囊胚活检的辅助检测方式，既能发挥其检测胚胎质量的优势，同时又避免了可能出现的失误。

2.囊胚腔液检测：囊胚腔液检测在样本质量良好和扩增成功的条件下，与细胞活检有着很高的一致性。Magli等统计了胚胎囊胚腔液检测与滋养外胚层活检的结果，发现囊胚腔液检测对倍性状态的敏感性和特异性分别为98%和93%。而囊胚腔液检测与滋养外胚层活检倍性状态和单条染色体的一致率分别是93.6%和98.4%。Cai等对经过形态学评估的147个胚胎进行检测，发现囊胚腔液检测有望减少非整倍体诱导的植入失败和流产，认为囊胚腔液检测具有较好的应用潜力。

但是，目前囊胚腔液检测在临床方面还未直接应用是因为在实际过程中很难保证囊胚腔液检测样本的扩增成功率。可能的影响因素包括：首先，抽吸上来的囊胚腔液体积非常小，大约0.01 μl，样本的提取和转移都有较大的技术难度；其次，囊胚腔液中cfDNA含量相对较少，全基因组扩增成功率低，在低扩增率下研究囊胚腔液cfDNA样本的遗传学状态更加困难。Capalbo等的研究中只有37.5%的核型与滋养外胚层细胞活检一致。Tobler等研究仅成功扩增了63%的样本，这些样本在随后的整体倍性状态对比中只有62%的一致率，这与研究者的期望存在较大差距。因此，开展囊胚腔液检测的适用条件还有待进一步探索，也需要进行更多可重复性实验验证其准确性。

三、niPGT-M与niPGT-SR的临床研究现状

受到现有DNA扩增和检测技术的制约，niPGT-M和niPGT-SR的研究范围相对有限。但随着各种检测手段精确度的进一步提高和无创胚胎染色体筛查技术的进步，niPGT-M与niPGT-SR的相关研究有望成为未来的热点。

1.niPGT-M：2015年，Wu等首次对α-地中海贫血患者的胚胎培养液进行检测，再将检测结果与卵裂球活检结果比较，研究发现通过cfDNA筛选携带α-地中海贫血致病基因胚胎的成功率为88.6%，其中第5天胚胎培养液样本检测成功率为90.2%，而传统卵裂球活检的成功率仅为82.1%，展现了niPGT-M具备良好的应用潜力。

随后，Liu等使用全基因组扩增方法对88个胚胎培养液中的cfDNA进行分析，检测到了β-地中海贫血携带的突变型IVSII654的存在。还有研究指出，利用含囊胚腔液的胚胎培养液检验β-地中海贫血更加准确，这可能是由于囊胚腔中凋亡细胞碎片的浓度更高，故cfDNA浓度上升。不过，也有研究者认为niPGT-M可能不适合用于临床，因为无论是囊胚腔液检测还是胚胎培养液检测，均无法避免较高概率的等位基因脱扣现象，即杂合细胞中两个等位基因中的一个扩增失败，从而导致检测结果准确性降低。因此，进一步拓宽研究领域、确认niPGT-M的适用条件非常重要。

2.niPGT-SR：2019年，Jiao等首次将胚胎培养液中cfDNA用于PGT-SR，成功获得了除Y染色体以外的23条染色体的结构信息，与囊胚活检和全囊胚检测在染色体重排方面的一致性达到100%，初步证实了开展niPGT-SR的可行性。2022年，胡静等选取84例患者作为研究对象，探索niPGT-SR和常规活检后行PGT-SR的一致性，结果显示二者在检测染色体结构异常和数量异常方面均具有一致性。上述临床研究初步证实了利用cfDNA开展PGT-SR的可行性,。但由于现阶段研究文献较少，缺乏多中心对照实验，故还需要进一步论证。

四、优化niPGT的探索

既往研究显示，目前niPGT研究面临的一大障碍就是研究之间结果差异大，即使是针对同一研究目的开展的实验，也会因为实验方法、参照标准、样本质控等因素的不同而结果存在较大差异。因此，为了更好地开展niPGT的研究，在此对能够优化niPGT的措施进行概述。

1.排除遗传污染：外源性遗传物质污染对niPGT结果准确性和一致性影响较大。常见的污染来源有精子、极体细胞和颗粒细胞等，为了最大限度减少污染，在选择体外受精方式时建议采用卵胞浆内单精子注射方式授精，避免精子的滞留。在授精前将包围卵母细胞的颗粒细胞去除干净，并且在将胚胎转入培养液之前清洗胚胎也可进一步去除颗粒细胞。

2.控制样本采集时间：无论是囊胚腔液检测还是胚胎培养液检测，使cfDNA浓度足够高，提高扩增的成功率是提高检测准确性的关键。对于胚胎培养液而言，在样本的不同时期进行采集，会影响cfDNA的浓度和质量。

Ho等的研究对cfDNA样本采用单细胞扩增，发现第5天培养液的扩增成功率是80.4%，显著高于第3天培养液的结果。Lane等在研究中发现，与第3天换液第5天收集的胚胎培养液样本相比，第4天换液第5天或第6天收集的样本可显著提高染色体检测的一致性。可以认为，随着胚胎发育与胚胎细胞的扩增，胚胎源的cfDNA浓度和比例都逐渐增高，所以适当延长样本采集的时间可能对优化PGT结果有一定帮助。但是人为增加胚胎的体外培养时间也可能对胚胎发育造成潜在的不良影响，因此，找到样本采集的恰当时机非常重要。

3.扩大niPGT检测的生物标志物范围：cfDNA并非评估胚胎发育潜能的唯一生物学标志物，近年来的研究中对细胞外囊泡、微小RNA（miRNA）等物质的检测也被认为是评估胚胎发育潜能的可能辅助手段。

细胞外囊泡包含外泌体、微囊泡和凋亡小体。Veraguas等研究发现囊泡直径与胚胎质量的存在一定关系，发育第3天质量最好的胚胎的细胞外囊泡直径显著大于质量较差的胚胎。Segura‑Benítez等在研究中发现，从细胞外囊泡中鉴定出ANXA2蛋白，该蛋白参与了与胚胎植入和早期胚胎发育相关的生物过程，这提示在标准化方案下对细胞外囊泡相关参数进行测量可能提供一种简单、无创并且成本较低的测试。

Rosenbluth等在非整倍体胚胎的胚胎培养液中发现miR-191浓度较高，并推测miR-191可作为胚胎倍性的生物学标记物；他们还发现在失败的体外受精胚胎中miR-372的浓度较高，推测高浓度miR-372具有预测受精失败的作用。Fang等在其研究中也得出某些miRNA分子可以作为生殖结果的潜在生物标志物的结论。

4.明确结果影响因素：就现阶段而言，胚胎培养液和囊胚腔液的采集和质量控制都缺少明确的标准，niPGT检测的准确性受到多种因素的影响，需要进行大量实验来明确。患者的年龄、用药方案、激素水平等因素都可能影响niPGT检测的准确性，所以需要进行对照实验来确认这类因素如何影响cfDNA的质量。

不同的扩增方式会影响cfDNA扩增的成功率和保真度。Kuznyetsov等利用SurePlex法扩增47个胚胎得到了100%的扩增成功率，且扩增产物更适用于染色体分析。而Shamonki等使用多重链置换扩增技术对57个胚胎样本进行扩增，结果只有2个能够开展后续分析。不过这两项研究的样本量较小，为确认不同扩增方式的效果，需要确保试验的稳定性和可重复性。

五、结语

总之，niPGT具有安全无创、操作方便、成本较低等优势，具有良好的临床应用前景。目前研究表明，这一技术受到样本量少、样本污染等问题的制约，其准确性在现有研究之间的差异较大，距离常规临床实践还存在一定距离。未来仍需要不断探索cfDNA产生的分子机制与检测方法，解决遗传污染问题，优化胚胎培养方案，提高niPGT的效度和信度。

文章来源：王嘉祥，田甜，张楠，等.无创胚胎植入前遗传学检测技术进展研究[J].生殖医学杂志，2024,33(7):965-970.