冠心病(coronary heart disease, CHD)是导致心血管疾病患者死亡的主要原因，给国家和个人都带来了沉重的经济负担。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是CHD的主要病理基础，其发病机制复杂。尤其有关不稳定AS斑块形成、破裂、愈合的机制尚不完全清楚，导致CHD的临床诊治策略存在局限性，缺乏早期诊断的方法及高效的斑块逆转策略。巨噬细胞炎症在AS斑块炎症应答中起核心作用，也是AS治疗策略研究的潜在的干预靶点。环状RNA在多种生物学进程中都发挥了重要作用，但是其对巨噬细胞炎症应答及AS斑块发生发展的作用尚不明确。

2024年7月19日，浙江大学郭晓纲、徐清波、程洪强团队在Cardiovascular Research上发表了题为“CircARCN1 Aggravates Atherosclerosis by Regulating HuR-mediated USP31 mRNA in Macrophages”的研究论文，揭示了巨噬细胞CircARCN1通过HuR-USP31轴在调控动脉粥样硬化斑块发生发展过程中起关键作用，为临床上冠心病的早期诊断及动脉粥样硬化的靶向治疗策略提供了新思路。

首先，研究者们通过对冠心病患者及健康对照者血液PBMC细胞转录组进行分析及RT-qPCR验证，发现CircARCN1在冠心病患者血液PBMC中水平增加，并且急性冠脉综合征(ACS)组的表达水平高于稳定型心绞痛(SA)组。进一步组织学分析发现，颈动脉AS斑块中CircARCN1表达显著高于非斑块组织，斑块内CircARCN1主要表达于巨噬细胞，并且随巨噬细胞炎症活化而表达增加(图1)。

图1. 环状RNA CircARCN1在单核及巨噬细胞中高表达，与动脉粥样硬化性心血管疾病及巨噬细胞炎症活化有关

巨噬细胞功能研究发现：沉默巨噬细胞CircARCN1表达，可抑制巨噬细胞NF-κB通路的活化，减少TNF-α、IL-1β、MCP1、MMP9等炎症介质的表达和释放，抑制THP-1细胞的迁移及黏附功能；相反地，过表达CircARCN1可促进巨噬细胞炎症应答(图2)。

图2. CircARCN1调节THP-1细胞炎症活化、黏附及迁移功能

一部分环状RNA的功能发挥常依赖其宿主基因的作用。对CircARCN1宿主基因ARCN1的研究却表明，ARCN1在斑块内的表达模式与CircARCN1不同，ARCN1沉默对巨噬细胞炎症应答没有影响。因而，CircARCN1所发挥的促炎作用与其宿主基因关系不大(图3)。

图3. CircARCN1的宿主基因ARCN1对巨噬细胞炎症应答无明确作用

后续对CircARCN1发挥作用的具体分子生物学机制进行了深入探讨。通过RNA pull down及质谱分析发现，CircARCN1与RNA结合蛋白HuR存在相互作用。通过HuR结构域缺失突变及RIP等研究手段确定了HuR与CircARCN1的相互作用依赖于其RRM结构域，尤其是RRM1结构域。通过FLASH-Seq及位点缺失突变研究确定了circARCN1与HuR相互作用的位点，功能回复实验也证实HuR是circARCN1调控巨噬细胞炎症的关键分子(图4)。

图4. CircARCN1与HuR相互作用

进一步分子生物学分析及研究发现，HuR-USP31调节轴是circARCN1发挥作用的关键。USP31是NF-κB通路的负调控因子。CircARCN1可影响HuR与USP31 mRNA之间的相互作用，削弱HuR对USP31 mRNA的保护作用，使得USP31 mRNA稳定性减弱，更易降解，从而降低USP31 mRNA的水平，降低USP31蛋白表达水平，促进NF-κB通路的活化(图5)。

图5. CircARCN1通过影响HuR和USP31 mRNA之间的相互作用，下调USP31的表达

应用巨噬细胞特异性干预载体进行小鼠在体实验研究，发现特异性敲降ApoE^-/- AS模型小鼠CircARCN1后，小鼠AS斑块负荷减少，斑块内脂质成分减少，巨噬细胞浸润减少，斑块内炎症反应减轻，斑块稳定性增加。相应的过表达实验也证实巨噬细胞CircARCN1可促进AS斑块进展(图6)。

图6. 巨噬细胞CircARCN1可以调节ApoE缺失小鼠的AS斑块发生发展

最后，研究者们回归临床，收集了391例临床血液样本，其中包括75例对照、136例稳定型心绞痛(SA)患者、180例急性冠脉综合征(ACS)患者，检测并分析了这些样本中CircARCN1的表达水平。通过组间比较、亚组间比较、PSM匹配、多元Logistic回归、ROC曲线等统计学分析，进一步确定CircARCN1表达水平与SA及ACS发病风险显著相关，是SA和ACS的分子生物学标记物(图7)。

图7. CircARCN1是稳定型心绞痛和急性冠脉综合征的分子生物学标记物

综上，该研究表明CircARCN1在冠心病患者血液中的水平升高，在AS斑块中表达增加。功能上，CircARCN1可促进巨噬细胞炎症反应，促进AS斑块进展。机制上，CircARCN1通过影响HuR和USP31 mRNA之间的相互作用，下调USP31表达，从而减弱USP31对NF-κB激活的抑制作用(图8)。总而言之，该研究为动脉粥样硬化的发病机制提供了新的线索，为冠心病的诊断及治疗提供了新的思路。

图8. CircARCN1作用机制模式图

浙江大学医学院附属第一医院心内科潘志成博士、吕佳兰博士、赵立丁博士为本文共同第一作者。浙江大学医学院附属第一医院郭晓纲教授、徐清波教授、浙江大学医学院程洪强教授为本文共同通讯作者。上述工作得到了国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金联合基金项目以及浙江省科学技术厅重点研发计划的资助。

原文链接：

https://doi.org/10.1093/cvr/cvae148