近日，深圳湾实验室孙坤课题组在Cell Reports Methods期刊发表题为《Systematic biases in reference-based plasma cell-free DNA fragmentomic profiling》的文章。该研究揭示了以参考基因组为基础的传统cfDNA分析流程中人种差异等因素所导致的系统偏差，并开发了一款无需参考基因组、快速、准确的cfDNA片段化组学分析算法Freefly。

研究发现

01 cfDNA传统处理方法存在系统误差

外周血循环游离DNA（circulating cell-free DNA，简称cfDNA）是一种细胞死亡后自然降解产生的DNA片段。cfDNA在癌症早期诊断、肿瘤起源追溯与分型、组织损伤监测等方向具有重要的意义。研究表明，肿瘤来源的cfDNA分子与背景cfDNA（主要来源于造血系统）存在显著的差异，例如片段大小、末端序列，是获得广泛验证的癌症检测标志物。在传统的分析流程中，为了获取cfDNA的片段大小和末端序列，需要将cfDNA测序数据比对到参考基因组上。该过程存在两个问题：一是参考基因组难以完美适配所有人种的基因序列，因此导致遗传背景依赖的偏差；二是所需要的时间较长，在一定程度上限制了cfDNA片段化组学在临床诊断中的实时应用。下图展示了在中国人群中，使用GRCh38（目前最常用的参考基因组）和Han1（来自中国南方人种）参考基因组得到的结果之间存在系统性偏差。

02 Freefly算法

为此，孙坤课题组开发了一款高速无偏cfDNA片段组学分析软件，命名为Freefly。该软件可以在不使用参考基因组的情况下，获得cfDNA片段化组学结果，从而避免了参考基因组带来的偏差，为cfDNA数据分析提供了更好的处理方案，并且在癌症早期诊断等多方面展现了其强大的潜力。

为测试Freefly算法性能表现，该研究使用多组数据来比较传统方法和Freefly性能表现。结果显示，处理50M读数，传统方法获取cfDNA特征值大约需要2小时，而Freefly仅需要2分钟左右即可完成，速度提升了约60倍（如下图所示）。与此同时，Freefly所获得的特征值（Size、CCCA End Motif、以及Motif多样性）与传统方法高度一致，甚至可以提供更好的诊断性能，表明了Freefly在癌症诊断中的价值。

研究支持

本论文所有作者均为深圳湾实验室肿瘤所孙坤课题组成员，其中孙坤博士为本论文的通讯作者，研究助理刘晓懿、联培博士生杨梦琦为本文的共同第一作者。该研究获得国家重点研发计划、广东省基础与应用基础研究基金项目、国家自然科学基金、深圳湾实验室重大项目、深圳湾实验室计算中心平台等支持。

原文链接

https://www.cell.com/cell-reports-methods/fulltext/S2667-2375(24)00149-8