RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体，不同类型RNA具有不同的作用。转移RNA（tRNA）在蛋白质翻译中起着重要作用。如果tRNA中发生错误修饰或修饰缺失，会产生错误或不完整的蛋白质。已有研究发现，多种tRNA修饰酶的突变与各种人类疾病有关，包括神经退行性疾病、代谢疾病和癌症。但是，研究tRNA一直面临着诸多挑战，部分原因是缺乏一种同时量化其丰度和化学修饰的简单方法。因为目前的纳米孔测序设置会丢弃绝大多数tRNA reads，测序产量低，并且基于转录物长度对tRNA丰度的表示有偏差。

近日，来自西班牙巴塞罗那科学技术研究所的研究团队及合作者在Nature Biotechnology发表了题为“Quantitative analysis of tRNA abundance and modifications by nanopore RNA sequencing”的研究论文。研究团队开发了一种名为Nano-tRNAseq的tRNA纳米孔测序新方法，可直接对天然tRNA进行精确测序，准确定量tRNA丰度并同时捕获tRNA修饰变化。研究团队利用Nano-tRNAseq成功检测了酿酒酵母tRNA群同一分子内不同tRNA修饰类型之间的串扰和相互依赖性，以及tRNA群体对氧化应激的反应变化。

文章发表在Nature Biotechnology

牛津纳米孔技术公司（ONT）开发的直接RNA测序（DRS）平台是基于NGS技术来描述tRNA组的一个很有潜力的替代方案。该技术允许对天然RNA分子进行直接测序，因此，原则上可以检测和定量tRNA修饰和tRNA丰度，不需要逆转录或PCR。先前的研究已经证明，纳米孔可以使用固态或生物（ONT）纳米孔捕获tRNA。通过连接接头来延长tRNA分子，tRNA可以通过生物纳米孔进行测序、基础标记和定位。但上述方法tRNA分子的测序产量较低，并且没有报告是否使用该方法再现了现存的体内tRNA丰度和/或tRNA修饰。

研究团队发现，对原始纳米孔信号强度再处理，用RNA接头填充5′和3′tRNA末端，可以准确地进行碱基判定和映射，并捕获整个tRNA序列，使tRNA reads的数量增加12倍，并获得准确的tRNA丰度。这种基于纳米孔的方法被命名为Nano-tRNAseq（图1），可用于对天然tRNA进行测序，并在单个实验中获取到tRNA丰度和修饰动力学的定量估计。

研究团队表示，在体外和天然tRNA分子测序、碱基判定和映射方面，Nano-tRNAseq方法是使用纳米孔进行DRS最成功的方法。

图1.Nano-tRNAseq可以有效地对天然tRNA进行测序。

天然tRNA具有短而高度修饰的特性，这使它们的比对具有挑战性。对DRS数据集中修改碱基的不准确判定也使原tRNA检测含有很大比例的不匹配碱基。由于这些错误的碱基，使用推荐设置的常用长读长映射工具minimup2（-ax-map ont-k15）仅可以比对一小部分reads（2.56%）。

为了提高Nano-tRNAseq reads可映射性，研究团队测试了短reads映射算法BWA，发现使用推荐参数的BWA-MEM比对在映射readas的比例方面优于minimup2。当使用参数为-W13 -k6 -xont2d -T20的BWA-MEM时，发现增加的映射reads和错误比对之间存在最佳平衡，映射了54.63%的reads，错误比对很少（0.19%）。当在天然tRNA分子中比较两个映射算法的性能时，对比更加明显。

随后，研究人员评估了Nano-tRNAseq reads的可映射性是否受5'和3' RNA接头长度的影响。研究发现，即使参考序列中没有RNA接头，短的和未修饰的序列也可以有效地比对，而短的和修饰的reads则从带有接头的延伸序列中受益匪浅，表明带有RNA接头的延伸序列分子对于指导富含“错配”短reads的正确比对至关重要，例如来自天然tRNA的短reads。（图2）

图2。映射软件和参数的选择显著影响映射tRNA reads数量。

MinKNOW软件用于分析每个孔处检测的连续电流信号，将对应于reads的信号转化为FASTQ文件（图3a）。研究人员通过调整其配置，与默认MinKNOW配置相比，捕获了约12倍的碱基调用（basecalled）和约4.5倍的唯一映射tRNA reads（图3b、c）。此外，使用自定义配置可以更好地概括tRNA  reads的相对比例（图3f），报告的tRNA丰度与预期值相关良好（图3g）。

图3.MinKNOW参数的调整增加了测序和映射tRNA  reads的数量。

DRS的情况下，天然RNA分子可以被测序，而cDNA链则不可以。接下来，研究人员分析了tRNAs的线性化是否会进一步提高测序产量。使用Nano-tRNAseq对酿酒酵母的总tRNA进行测序，分为有和没有逆转录步骤，发现在MinKNOW默认配置中，无逆转录步骤的reads数量更多。原因在于非线性化的tRNA比线性化的tRNA更结构化，导致解旋酶处理这些分子的速度更慢，可能增加了其被MinKNOW分类为reads的可能性。总之，tRNA分子的线性化提高了测序产量，因此逆转录步骤包括在所有随后的Nano-tRNAseq文库制备中。（图4）

通过进一步试验验证，研究人员证实Nano-tRNAseq可以量化tRNA丰度、tRNA修饰差异，识别tRNA修饰的相互依赖性。

图4：Nano-tRNAseq可以量化tRNA丰度和RNA修饰，以及捕获修饰的相互依赖性。

综上所述，Nano-tRNAseq方法能够使用纳米孔DRS准确且直接地以单转录物分辨率量化tRNA丰度和修饰谱，是一种简单、稳健、有效的tRNA测序方法。在文库制备方案中，成熟tRNA的5’和3’末端用RNA接头延伸，提高了tRNA分子的碱基调用和可映射性。研究人员通过自定义的MinKNOW配置更有效地捕获tRNA reads，且与tRNA长度无关，消除了长度依赖性偏差。该方法将有助于揭示tRNA生物学的动力学，并可能在不久的将来用于人类疾病的诊断和预测。

该文章通讯作者、基因组调控中心研究员Eva Maria Novoa博士表示：“tRNA分子可以被切割成小而稳定的RNA片段并在血浆中循环。这些分子在癌症患者中通常会发生改变，并且携带丰富的诊断和预后信息。Nano-tRNAseq是一种概念验证技术，可以以非侵入性方式量化这些分子，为开发一种简单、经济高效、高精密的方法铺平了道路。我们的目标是进一步开发这项技术，并将其与人工智能工具相结合，在不到3小时的时间内确定生物样本的恶性程度，且每个样本的成本不超过50欧元。”

参考资料：

Lucas MC, Pryszcz LP, Medina R, et al. Quantitative analysis of tRNA abundance and modifications by nanopore RNA sequencing [published online ahead of print, 2023 Apr 6]. Nat Biotechnol. 2023;10.1038/s41587-023-01743-6. doi:10.1038/s41587-023-01743-6

https://www.nature.com/articles/s41587-023-01743-6、