HBV感染是全球重要公共卫生问题之一^[1-2]。但由于对HBV生命周期的认识还不够充分，目前尚缺乏有效治愈慢性乙型肝炎(CHB)的药物。因此，深入解析HBV复制的调控机制，将为抗HBV新药物研发提供有效靶点。

HBV属嗜肝DNA病毒科病毒，基因组为部分双链的松弛环状DNA(rcDNA)，其复制过程有着独特的逆转录步骤^[3]。研究^[4-5]表明，HBV的复制依赖于肝细胞的细胞周期。例如，HBV在静止肝细胞中的复制更为活跃，而在细胞开始分裂时复制减慢。细胞周期素D1(cyclin D1，基因名CCND1)是细胞周期进程的正性调节因子，可通过结合并激活细胞周期素依赖性激酶(CDK)4、6，促进细胞由静止期(G0)或间期1(G1)进入DNA合成期(S)。研究^[6-7]发现，cyclin D1在包括肝癌在内的多种肿瘤组织中呈异常高表达，但cyclin D1是否影响HBV复制目前尚未见报道。本研究通过挖掘公共数据库数据以及应用HBV复制细胞模型，探究cyclin D1对HBV复制的影响，并对其调控HBV复制的可能机制进行分析。

1 材料与方法

1.1   材料

人肝癌细胞系HepG2购自美国ATCC数据库，Huh-7细胞购自上海中科院细胞库。pFLEX-cyclin D1-T286A、pGL3-HBV BCP、Actin-Renilla和pGL3-basic质粒为本室前期保存构建。prcccDNA/pCMV-Cre重组质粒系统由prcccDNA质粒和pCMV-Cre表达质粒组成^[8]，为复旦大学基础医学院邓强教授惠赠。

1.2   细胞培养与转染

HepG2和Huh-7细胞均采用含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素、链霉素的DMEM培养基，在37 ℃和含5% CO₂的细胞培养箱中常规培养。细胞转染前1天，将生长状态良好的细胞按1.5×10⁵个/孔接种至12孔板，其中HepG2细胞接种前需铺好鼠尾胶原。按照Lipofectamine^TM 2000(购自美国Invitrogen公司)说明书进行质粒转染，6 h后更换新鲜培养基继续培养，72 h后收集培养上清及细胞沉淀用于后续实验研究。

1.3   质粒构建

采用同源重组的方法构建pCMV-cyclin D1表达质粒，其中扩增cyclin D1编码区的引物序列为：上游5′-ATTGTACCCGCGGGCCATGGAACACCAGCTCCTGTGC-3′，下游5′-GGATCCCCGCGGCCGCGTCACTTGTCATCGTCATCCTTGTAATC-3′。cyclin D1持续激活突变体表达质粒pCMV-cyclin D1-T286A是在pFLEX-cyclin D1-T286A质粒基础上，采用双酶切连接的方法构建而成。上述质粒DNA的序列均经测序验证[测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成]。

1.4   HBsAg和HBeAg检测

使用时间分辨免疫荧光法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg，检测试剂盒购自苏州新波生物技术公司。所用检测设备为SYM-BIO Anytest时间分辨荧光分析仪(上海新波生物技术有限公司)。

1.5   HBV DNA定量检测

细胞培养上清用3000 r/min离心3 min，吸取200 μL上清首先进行95 ℃加热10 min，使病毒蛋白变性，然后使用Light Cycle 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪和罗氏2×SYBR Green Mix进行HBV DNA相对定量检测。上游引物序列为5′-CGGCGTTTTATCATMTTCCTCT-3′，下游引物序列为5′-GACAAACGGGCAACATACCTT-3′。

1.6   反转录-实时荧光定量PCR(RT-qPCR)实验

Trizol法提取细胞总RNA，采用Roche反转录试剂盒(购自美国罗氏公司)逆转录为cDNA。取2 μL cDNA为模板，使用2×SYBR Green Mix(购自美国罗氏公司)进行实时荧光定量PCR检测细胞内HBV mRNA表达水平，以管家基因ACTIN作为内参。HBV RNA检测所用引物序列如下：3.5 kb HBV RNA上游引物为5′-AGACCACCAAATGCCCCTATC-3′，下游引物为5′-TCTGCGAGGCGAGGGAGTTC-3′，可检测pgRNA和preC mRNA两种RNA；preC mRNA上游引物为5′-TCTGCGCACCAGCACCATG-3′，下游引物为5′-CAATGCTCAGGAGACTCTAAGGC-3′。宿主基因APOBEC3G上游引物为5′-GCATCGTGACCAGGAGTATGA-3′，下游引物为5′- GTCAGGGTAACCTTCGGGT-3′；牛磺胆酸钠共转运多肽(NTCP)上游引物为5′-AAGGACAAGGTGCCCTATAAAGG-3′，下游引物为5′-TTGAGGACGATCCCTATGGTG-3′；肝细胞核因子1α(HNF1α)上游引物为5′-AACACCTCAACAAGGGCACTC-3′，下游引物为5′-CCCCACTTGAAACGGTTCCT-3′；染色体结构维持复合物5(SMC5)上游引物为5′-TCCCGAGAGACCCTTCGTC-3′，下游引物为5′-TTCCATTGGCTCCAACGATCA-3′；叉头盒转录基因M1(FOXM1)上游引物为5′-ATACGTGGATTGAGGACCACT-3′，下游引物为5′-TCCAATGTCAAGTAGCGGTTG-3′；ACTIN的上游引物为5′-TTGTTACAGGAAGTCCCTTGCC-3′，下游引物为5′-ATGCTATCACCTCCCCTGTGTG-3′。

1.7   Western blot实验

收集细胞沉淀，加入约细胞体积3倍的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，12 000×g、4 ℃离心10 min后取上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭60 min，按各抗体说明书使用量稀释后加入适量一抗4 ℃摇床杂交过夜，加入二抗(二抗原液按1∶8000稀释)室温孵育2 h。使用Odyssey双色红外激光成像系统(美国LICOR公司)和Odyssey V1.2软件进行杂交膜的扫描和分析。

1.8   双荧光素酶活性检测

为了确定cyclin D1对HBV基本核心启动子(BCP)活性的影响，将带有HBV BCP区的pGL3荧光素酶报告载体(pGL3-HBV BCP)与pCMV-cyclin D1或pCMV-cyclin D1-T286A共转染HepG2细胞，同时共转Actin-Renilla质粒作为内参对照。转染48 h后，使用Dual Luciferase Reporter Assay试剂盒中的Passive Lysis Buffer裂解细胞，吸取25 μL上清检测萤火虫和海肾萤光素酶活性，以萤火虫/海肾的比值表示报告基因的活性。所用设备为多功能酶标仪(PerkinElmer公司)。

1.9   数据下载与分析

在GEO数据库(Gene Expression Omnibus, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载转录组数据集GSE84044和GSE83148^[9-10]。GSE84044收录了124例HBV相关肝纤维化患者肝组织的转录组数据，GSE83148收录了122例CHB患者肝组织的转录组数据。通过limma包^[11]，对下载的数据进行了归一化处理。在分析与HBV DNA相关的宿主基因时，选择了GSE84044数据集中性别为男性且血清HBV DNA载量大于10⁴拷贝/mL的患者共计59例。

2 结果 

2.1   肝组织CCND1表达水平与血清HBV DNA载量呈负相关

通过分析GSE84044数据集中59例男性HBV相关肝纤维化患者肝组织的转录组数据，共找到了765个表达水平与患者血清HBV DNA水平显著相关的宿主基因(FDR＜0.05，|r|＞0.3，图1a)。通过与116个细胞周期基因(ko04110)取交集，发现其中有7个基因为细胞周期相关基因，且这7个基因在肝脏中的表达水平均与血清HBV DNA水平呈显著负相关(FDR＜0.05，r值均＜-0.3，P值均＜0.05) (图1a、1b)，按相关性由强到弱排序依次为MYC、TGFB1、CCND1、YWHAZ、HDAC1、YWHAB和E2F3。其中，CCND1是调控细胞从G0/G1期向S期转换的关键因子，其表达水平与HBV DNA载量呈显著负相关(r=-0.474，P＜0.001)(图1c)。

图1  肝组织基因表达与血清HBV DNA的相关性分析

注：a，GSE84044数据集中与患者HBV DNA载量相关的肝组织宿主基因，样本按照HBV DNA载量的高低从左到右排列，蓝色代表低表达，红色代表高表达；b，765个与HBV DNA载量显著相关基因和116个细胞周期基因的交集；c，肝组织中CCND1水平与血清HBV DNA载量之间的相关性分析。

2.2   外源表达cyclin D1抑制HBV复制

为探究cyclin D1蛋白对HBV复制的影响，构建了pCMV-cyclin D1和pCMV-cyclin D1-T286A表达质粒，并将上述质粒分别与prcccDNA/pCMV-Cre质粒体系共同转染至HepG2及Huh-7细胞中，72 h后收集细胞沉淀和细胞培养上清液。Western blot实验证实pCMV-cyclin D1和pCMV-cyclin D1-T286A表达质粒均可在两种细胞中成功表达，且cyclin D1和cyclin D1(T286A)过表达均能显著降低细胞内HBV core蛋白水平(图2a、2b)。与此结果一致，过表达cyclin D1和cyclin D1(T286A)亦显著下调了两种细胞上清液中的HBsAg、HBeAg和HBV DNA水平(图 2c、d)。

图2  外源表达cyclin D1降低HBV的复制水平

注：a、b，外源表达cyclin D1降低HepG2和Huh-7细胞HBV core蛋白的水平；c、d，外源表达cyclin D1下调HepG2和Huh-7细胞培养上清液中的HBsAg、HBeAg与HBV DNA水平。

2.3   外源表达cyclin D1在转录水平抑制HBV复制

为了探究cyclin D1蛋白抑制HBV复制的可能环节，采用RT-qPCR方法，在HepG2细胞中检测了cyclin D1和cyclin D1(T286A)对HBV RNA水平的影响。结果显示，过表达cyclin D1和cyclin D1(T286A)均可显著抑制HepG2细胞中HBV的3.5 kb mRNA及preC mRNA水平(图3a)。与此一致，双荧光素酶报告基因实验证实，过表达cyclin D1和cyclin D1(T286A)均显著抑制了HBV BCP启动子活性(图3b)。

图3  外源表达cyclin D1对HBV转录水平的影响

注：a，RT-qPCR检测cyclin D1和cyclin D1(T286A)过表达对HepG2细胞内HBV RNA的影响；b，双荧光素酶报告基因实验检测过表达cyclin D1和cyclin D1(T286A)对HBV BCP启动子活性的影响。

2.4   cyclin D1通过下调HNF1α和NTCP表达抑制HBV复制

为了进一步探究cyclin D1抑制HBV复制的可能机制，利用GSE83148数据集中122例CHB患者的肝脏转录组数据，分析了CCND1与10个已报道调控HBV复制的重要宿主基因的相关性(图4a)。结果显示，CCND1水平与抑制HBV复制的APOBEC3G(r=0.575，P＜0.001)、SMC5(r=0.341，P＜0.001)和FOXM1(r=0.333，P＜0.001)表达呈显著正相关，而与HBV进入受体NTCP(r=-0.511，P＜0.001)和HBV复制正向调控转录因子HNF1α(r=-0.430，P＜0.001)表达呈显著负相关。采用RT-qPCR方法，对与CCND1表达相关性较高的APOBEC3G、NTCP、HNF1α、SMC5和FOXM1进行了定量分析。结果显示，在HepG2细胞中过表达cyclin D1降低了HNF1α(P＜0.001)和NTCP(P＜0.01)的RNA水平，同时也抑制APOBEC3G和SMC5表达(图4b)。

图4  CCND1与HBV调控基因的表达相关性分析

注：a，CHB肝组织中CCND1与多个HBV调控基因的表达相关矩阵；b，RT-qPCR方法检测cyclin D1对HepG2细胞内APOBEC3G、NTCP、HNF1α、SMC5和FOXM1表达的影响。

3 讨论

病毒需要依附活细胞才能完成其生命周期，故病毒与宿主细胞之间存在大量互作调控。已有研究^[4]报道，HBV复制依赖于细胞周期，肝细胞的快速增殖可以抑制HBV复制，但其机制尚未阐明。本研究发现细胞周期调控关键蛋白cyclin D1可以抑制HBV复制，机制上可能与cyclin D1抑制HNF1α和NTCP表达有关。

已有研究^[4]发现，HBV感染能使原代肝细胞富集于G2/M期，同时促HBV复制的细胞转录因子如PPARA、RXRA和CEBPB等也在HBV感染时上调，表明HBV复制可能更易在增殖抑制的肝细胞中复制。在增殖旺盛的肝癌组织中，HBV cccDNA及HBV复制水平则显著低于癌旁组织，进一步证实增殖的肝细胞不利于病毒复制^[13]。与上述发现一致，本研究通过对GEO数据库的肝脏转录组数据集分析发现，有7个细胞周期调控相关的基因表达与患者血清HBV DNA载量呈负相关，分别为MYC、TGFB1、CCND1、YWHAZ、HDAC1、YWHAB和E2F3。其中，已有文献报道MYC^[14]及TGFB1^[15]可以通过不同机制抑制HBV的复制，这与本研究的分析结果相符合。HDAC抑制剂^[5]如FK228/SAHA以及敲减HDAC1基因，均可通过上调p21诱导细胞发生G0/G1期阻滞，进而促进HBV复制。但CCND1、YWHAZ、YWHAB和E2F3是否影响HBV复制目前未见报道。

CCND1基因编码的蛋白产物为cyclin D1。cyclin D1是调控细胞周期由G0/G1期向S期转换的关键因子。cyclin D1可与CDK4/6形成复合物，进入细胞核内使RB蛋白磷酸化，并使后者失去对转录因子E2F的抑制，进而上调cyclin E、cyclin A的表达，从而启动细胞向S期转换。cyclin D1主要经泛素-蛋白酶体系降解，其出核主要由出核运输蛋白CRM1介导^[16]，CRM1与cyclin D1结合依赖于cyclin D1第286位苏氨酸(T286)磷酸化^[17]。当T286A突变导致该磷酸化基序丢失时，突变cyclin D1主要定位于细胞核内，可促进细胞异常增殖。本研究发现，表达外源cyclin D1及cyclin D1(T286A)突变体均能显著抑制HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平，以及细胞内HBV RNA和HBV core蛋白水平，表明cyclin D1能抑制HBV复制。HBV BCP启动子主要调控3.5 kb mRNA的转录，其中pgRNA既可作为mRNA翻译合成病毒core蛋白和P蛋白，也可作为反转录的模板在核衣壳内合成rcDNA，而preC mRNA则主要翻译外泌的HBeAg。本研究发现cyclin D1能显著抑制BCP区的转录活性，提示cyclin D1可在转录水平抑制HBV复制。笔者团队也注意到，cyclin D1及cyclin D1(T286A)突变体对HBV复制的抑制作用未见明显不同，且二者对HepG2和Huh7细胞增殖的影响也不大，可能与本研究采用的HBV复制模型是增殖速度较快的肝癌细胞株有关，未来需要在原代肝细胞中加以验证。

目前认为，细胞周期影响HBV复制的机制主要有3个方面：(1)抑制HBV进入肝细胞的功能性受体NTCP表达，从而抑制HBV的从头感染^[13, 18]；(2)影响HBV复制调控分子的表达，如HNF4α、RXRA和CEBPB等^[4]，从而抑制HBV基因的转录；(3)影响HBV的成熟和释放^[19-20]。本研究通过对数据分析发现，CHB患者肝组织中的CCND1与APOBEC3G、SMC5和FOXM1呈显著正相关，而与NTCP和HNF1α呈显著负相关。笔者团队的前期研究^[13]发现，cyclin D1可抑制NTCP表达，提示cyclin D1也能抑制HBV对肝细胞的从头感染。HNF1α能够调控cccDNA的大部分调控元件(包括preS1启动子^[21]、核心启动子^[22]和增强子Ⅱ^[23])，在HNF1α缺失的情况下HBV复制能力显著降低^[24]。本研究进一步证实过表达cyclin D1能够抑制HNF1α和NTCP的表达，提示cyclin D1抑制HBV复制可能与其对HNF1α和NTCP的调控有关。

综上，本研究发现细胞周期关键蛋白cyclin D1可通过抑制HBV基因转录来抑制病毒复制，可为进一步阐明细胞周期调控HBV复制的分子机制提供理论依据，并为抗HBV新药研发提供潜在的分子靶点。

引证本文

彭思雯, 关贵文, 张婷, 等. 细胞周期素D1对HBV转录和复制的影响[J]. 临床肝胆病杂志, 2023, 39(2): 316-324.