肺动脉高压 (PH) 是一种危及生命的疾病，其特征是肺动脉重塑，包括小动脉进行性闭塞，可导致肺血管阻力增加和致命的呼吸和循环衰竭。通过二维成像方法对 PH 血管的组织学分析表明，随着平滑肌细胞 (SMC) 和内皮细胞 (EC) 的增殖，收缩性向内重塑。尽管使用共聚焦和多光子显微镜的 3D 组织可视化系统允许对多个器官中的复杂微结构进行成像，但血管结构变化的成像仍然具有挑战性，因为组织不透明度、光散射和吸光度等因素限制了光穿透深度≈100至200微米。最近在组织清除技术方面取得的显着进展已经能够克服这些技术障碍，无需薄切片即可可视化整个器官。具体来说，清晰无障碍的大脑/身体成像鸡尾酒和计算分析 (CUBIC) 技术是一种新开发的组织清除方法，可以对整个器官进行 3D 成像。

为了分析 PH 中的血管重塑，该研究使用 CUBIC 组织清除方法和多光子显微镜开发了一种新的鼠肺血管系统 3D 可视化系统。

对于样品制备：

将小鼠经心脏依次灌注磷酸盐缓冲盐水中的 4%多聚甲醛和 50% CUBIC-1 试剂。 右肺的后腔叶被切除并在 37 °C 下连续浸入 CUBIC-1 试剂中，5 天用于全贴装染色或 1 天用于荧光蛋白标记。 接下来，对于整体免疫染色，将肺浸入 20% 蔗糖的磷酸盐缓冲盐水中，在 -80 °C 的最佳切割温度化合物中冷冻过夜以增加抗体渗透，在室温下解冻，然后 然后使用稀释在 2% Triton X-100-磷酸盐缓冲盐水中的一抗进行全贴免疫染色 3 天。 最后将荧光蛋白标记和染色的样品浸入 CUBIC-2 试剂中 1 天，然后通过多光子激发荧光显微镜和瓷砖扫描进行成像。

使用 3D 图像对肺血管系统进行形态学和定量评估

肺组织成功透明化（图B），可归因于表达 tdTomato 或荧光素异硫氰酸酯偶联的抗α平滑肌肌动蛋白抗体染色的 ECs 的荧光能够在肺 EC 特异性表达 tdTomato 的小鼠（图C);因此，在缺氧诱导的 PH 小鼠模型中分析了 3D SMC 重塑。传统的组织病理学分析显示更多数量的 α 平滑肌肌动蛋白染色的小动脉（图D），其先前已被表征为非肌肉化血管的远端小动脉肌化和 PH 中的中层肥大。此外，α 平滑肌肌动蛋白染色的 SMC 的 3D 成像可以描绘先前未表征的 SMC 在缺氧诱导的 PH 中分支和延伸到外周肺中（图E），其被定量评估为 SMC 延伸指数（图F和G）。

为了进一步表征 SMC 重塑并验证血管生成与EC周围萌芽，SMC 增殖的参与，该研究通过将 Rosa26-lsl-tdTomato 与携带 VE-钙粘蛋白的小鼠杂交，在缺氧诱导的 PH 小鼠中进行了3D EC 谱系追踪实验。 在 5 周龄时给予单剂量的他莫昔芬（5 毫克/千克体重），并在 11 周龄正常氧或缺氧条件下进行 3 周后对小鼠进行 3D 成像。 3D EC 谱系追踪分析清楚地显示了 PH 发展过程中 EC 的萌芽和伸长，主要是在肺表面附近，这在二维 EC 谱系追踪成像中并不明显（图H和I）。这种血管生成反应被定量评估为血管生成指数（图J和K）。

该研究使用新的 3D 可视化系统和量化方法在缺氧诱导的 PH 小鼠模型中描述了新的血管重塑。固定液和 50%CUBIC-1 试剂的即时和顺序灌注对于更好的组织透明度和清晰的 3D 可视化至关重要。在最佳切割温度化合物中冷冻和解冻组织，并使用更高浓度的洗涤剂 (2% Triton X-100) 的抗体溶液中需要增加抗体渗透和信号强度。该 3D 系统可以在合并 PH 中的形态和表型以及可能的其他条件方面提供显着优势。在神经科学中，全面的 3D 成像已被用于检测肿瘤侵袭和转移、神经兴奋和细胞衰老。 其他细胞类型（如免疫细胞及其来源、分化和功能的定义标记）的共可视化将揭示空间PH 中的异质性及其对血管重塑的贡献，从而更好地了解 PH 的机制。

文献出处：

Fujiwara T, Takeda N, Hara H, Ishii S, Numata G, Tokiwa H, Maemura S, Suzuki T, Takiguchi H, Kubota Y, Seo K, Sakata A, Nomura S, Hatano M, Ueda K, Harada M, Toko H, Takimoto E, Akazawa H, Nishimura S, Komuro I. Three-Dimensional Visualization of Hypoxia-Induced Pulmonary Vascular Remodeling in Mice. Circulation. 2021 Oct 26;144(17):1452-1455. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.121.056219. Epub 2021 Oct 25. PMID: 34694894.