氢气治疗对高血脂症和相关疾病（如非酒精性脂肪肝）的疗效观察
时间：2022-11-21 12:00:25 热度：37.1℃ 作者：网络
【背景分析】
氢气作为最轻、自然界中含量最丰富的化学元素，被认为是一种新型抗氧化剂，可以减少氧化应激【1】。从2007年起，氢气成为治疗性医用气体研究的前沿。许多临床和实验模型，在生物医学领域积累的大量证据，通过吸入氢气、或者富含氢元素的水溶液作为给药方式，氢气在不同的疾病模型中，表现出了安全可行的治疗潜力。
例如，补充富含氢的水溶液，被证明对预防2型糖尿病和胰岛素抵抗具有积极作用【2】, 慢性肝脏炎症【3】、急性氧化应激、局部脑缺血/再灌注损伤【1】。据报道，口服氢水6个月，可预防载脂蛋白E敲除（apo E−/−）小鼠的动脉粥样硬化，主要是通过降低体内氧化应激水平实现【4】。因此，氢气能够影响血浆脂质和血浆脂蛋白水平，使得利用氢气治疗高脂血症成为可能。
血浆高密度脂蛋白（HDL）的功能和浓度，与动脉粥样硬化性心血管疾病风险呈现很强的负相关性【5、6】。已知高密度脂蛋白在炎症和氧化应激的协同作用下，会发生结构和组成的显著改变【7、8】，导致HDL分子逐渐失去正常的生物活性。而氢是电子供体，具有高还原能力。因此，具备在动物或患有高脂血症、以及其他心血管疾病的患者中进行氢气治疗，可能会改善因高脂血症造成的HDL损伤，提高其抗动脉粥样硬化的功能。
来自我国山东第一医科大学，由秦树存教授领导的科研团队，经过4年（2012-2016）研究，证明了通过服用富含氢元素的饮用水（以下简称富氢水）、吸入氢气（3L/min）对应预防和治疗中老年高脂血症，以及相关疾病（如非酒精性脂肪肝）具有明显疗效。
【动物实验】
本次实验，旨在检验氢气对黄金仓鼠HDL分子功能特性的影响。实验使用45只雄性叙利亚金仓鼠，随机分为5组，分别是常规饲料组（5只，简称CD）、高脂饮食组（10只，简称HFD）、HFD低剂量氢干预组（10只，简称HFD+H2-L，1ml/KG/d），HFD中等剂量氢干预组（10只，HFD+H2-M,2.5ml/KG/d）和HFD高剂量氢干预组（10只，简称HFD+H2-H,5ml/KG/d）。5组小鼠分别喂食常规饲料（CD）和高胆固醇饲料（15%猪油混合0.2%胆固醇）。
实验共进行8周，前4周按照分组，分别饲喂常规饲料、以及高胆固醇饲料；后四周，按照分组，每天注射普通生理盐水和富氢生理盐水。
实验结束后，将小鼠麻醉采集血液，通过酶法测定血浆总胆固醇 （TC）、甘油三酯 （TG）、高密度脂蛋白胆固醇 （HDL-C） 和低密度脂蛋白胆固醇 （LDL-C） 的浓度，通过快速蛋白液相色谱（FPLC）获得脂蛋白谱【9】。
结果一：氢气可降低血浆 TC 和 LDL-C 水平
如下图所示，与常规饲料组CD相比，高脂饮食饲组HFD导致血浆TC、LDL-C、HDL-C和TG水平显著增加，分别增加了4.2、2.5、2.7和3.9倍，这表明成功制备了高脂血症仓鼠模型。
如下图所示，氢气治疗4周后的结果显示，与HFD对照组相比，血浆TC和LDL-C水平分别显著降低28.3%和34.3%。
结果二：氢气下调血浆中的apoB和apoE蛋白水平
与上面与LDL-C观察到的差异一致，LDL上的主要蛋白质apoB100和apoB48，在喂食HFD的动物中通过氢气处理显著降低，LDL分子中的apoE蛋白也随着氢气的处理而下调。
同时，分离的VLDL颗粒的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）显示氢气显著降低VLDL中apoE的含量。
这些数据表明氢气可以下调LDL和VLDL的主要蛋白质成分的表达，这与FPLC血浆脂蛋白谱的数据一致。
结果三：氢气可改善高脂血症仓鼠HDL分子的活性
高密度脂蛋白在炎症和氧化应激的协同作用下，会发生结构和活性的显著改变【7、8】。氢气通过发挥抗氧化和抗炎作用，在多种疾病模型中充当治疗性医疗气体【2、4、10】。氢气干预改善HDL分子的活性，验证过程如下：
首先，研究团队测试了分离的HDL分子从载有胆固醇的巨噬细胞中引起流出的能力。
如上图所示，与常规CD组相比，HFD治疗降低了HDL引发外排的能力，表明HDL颗粒介导的胆固醇外排能力受到高脂血症的损伤；然而，从氢气处理的仓鼠中分离出的HDL，表现出显著更高的流出特性。
接下来，测试了氢气对HDL抗氧化功能的生物学效应，即保护LDL分子免受氧化。
如上图所示，与CD组相比，HFD喂养后TBARS的形成有增加的趋势；不同剂量的氢气处理，均显著抑制了TBARS的形成。这些数据表明高脂血症损伤的HDL功能，包括刺激巨噬细胞泡沫细胞胆固醇流出的能力，和防止LDL氧化的能力，通过氢气干预得到改善。
然而，HDL上的主要蛋白质，apo A-I和apo A-II水平（结果如上图所示），在喂食HFD的动物中没有被氢气处理显著改变，这也是本实验需要进一步确认的结果之一。
本实验的意义在于，实验数据为提供了一个线索，即氢气有可能被用作新型调脂剂，与其他对肝脏和肾脏有不良影响的常用调脂药物相比，安全性是它最大的优势。当转化为临床实践时，吸入氢气，未来可能用于治疗高脂血症患者。但是，也需要进一步了解与氢气影响脂质和细胞代谢的能力，以及有关的信号通路的潜在机制，才能充分利用吸入氢气作为治疗策略。
【临床试验—饮用富氢水】
动物实验虽然揭示了氢气干预可以作为新型调脂剂，但也指出：需要进一步了解与氢气影响脂质和细胞代谢的能力，以及有关的信号通路的潜在机制，才能充分利用吸入氢气作为治疗策略。为此，研究团队在2013年、2015年，又进行了两次试验。
本章介绍2015年的试验，着重讨论饮用富氢水对高脂血症患者的疗效，及其作用机制。该试验为一项双盲、随机和安慰剂对照试验。
本次试验共有68名患有高胆固醇血症的受试者参与（35-60 岁），参与者血浆TC>5.18mmol/L，/或 LDL-C>2.59mmol/L【11、12】，试验前至少3个月未接受任何降血脂药物治疗。同时，研究团队排除了6 个月内有任何急性和慢性炎症过程、2期或3期高血压、不稳定冠状动脉疾病、心肌梗死或中风、有症状的充血性心力衰竭、糖尿病、自身免疫性疾病、甲状腺疾病、慢性胰腺炎、受损的患者肾或肝功能、肾病综合征和体重指数>35kg/㎡的参与者。
患者通过计算机，以 1:1 的比例随机分配到富氢水组或安慰剂组（纯净水）中。每天饮用0.9 L（0.3 L/次，3次/d）富氢水，富氢水和纯净水均装在密封袋中，要求打开后5分钟内喝完。试验共10周，并分别在试验前、试验结束时采集患者血液进行化验，对比效果。
结果一：氢气提高了人前β1高密度脂蛋白（pre-β1-HDL）水平，同时不会降低卵磷脂胆固醇酰基转移酶 （LCAT） 活性
HDL的作用发挥，和HDL活性、以及pre-β1-HDL蛋白水平有关【13】。pre-β1-HDL蛋白是游离态胆固醇的第一个受体，同时受到LCAT活性影响【14】。
如上图所示，富氢水组（H2）显示血浆pre-β1-HDL水平显著增加（图A），同时LCAT水平并未受到明显影响，而LCAT对pre-β1-HDL成熟至关重要，这表明富氢水干预增加了前pre-β1-HDL水平，同时没有降低LCAT活性。
同时，研究团队评估了HDL3中的脂质水平（图C），显示富氢水干预显著降低了磷脂水平（磷脂水平反应了患有某些慢性疾病的可能，如肝硬化、糖尿病、原发性高血压、甲状腺功能减退等等。体重基数过大、过度肥胖的患者，体内的磷脂水平超标的可能性更高。磷脂的正常水平在130～220mg／dl之间，平均值为176mg／dl）；同时，HDL3中的S1P（1-磷酸鞘氨醇 ）和神经酰胺含量没有明显变化。
结果二：氢气干预通过上调ABCA1的表达促进胆固醇流出
为了验证氢气富氢水的干预，是否通过上调ABCA1的表达促进胆固醇流出，研究团队首先在有或没有格列本脲（一种常用的 ABCA1 化学抑制剂）的情况下测量了血浆HDL3介导的骨髓巨噬细胞流出。
结果如上图A所示，富氢水组的细胞胆固醇流出能力，明显高于安慰剂组的HDL3；然而，使用格列本脲没有显著差异（图B）。
同时，使用 RAW264.7 巨噬细胞，观察到同样的胆固醇流出的结果。富氢水组的总流出量明显高于安慰剂组（图 C），而，对于 ABCA1 受腺苷-3',5'-环磷酸（cAMP）刺激的RAW264.7巨噬细胞，富氢水组的总流出量显著高于安慰剂组（图D）。
结果三：氢气干预改善HDL3除胆固醇流出外的其他功能特性
研究团队首先测试了氢气对HDL3抗氧化功能的生物学效应，即防止LDL被氧化。
如图A所示，氢气治疗显著抑制了硫代巴比妥酸反应物质的形成，这得到了接受富氢水治疗的患者，血浆ox-LDL水平降低（图B）。
接下来，测试了氢气抗凋亡功能的生物学效应。
如图C所示，用ox-LDL处理细胞会导致细胞活力降低和凋亡细胞数量急剧增加，而这可以通过HDL预处理来阻止。此外，从富氢水组分离的HDL，对细胞凋亡的抑制作用显著高于从安慰剂组分离的HDL（图D）。
最后，研究团队测试了氢气对HDL3抗炎特性的影响，包括预防ox-LDL诱导的单核细胞粘附到内皮细胞和分泌粘附分子和炎症因子，细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）和IL-6。
如图A、图B所示，HUVECs与ox-LDL作用6小时后，单核细胞与HUVECs的粘附显著增加，随后被HDL干预阻止。从富氢水组分离的HDL3对粘连的预防，作用明显高于从安慰剂组分离的HDL3。
此外，ox-LDL诱导的与从安慰剂组分离的HDL3干预相比，与从富氢水组分离的HDL3干预相比，ICAM-1和VCAM-1以及IL-6 的分泌显著降低（图C、D、E），这些数据表明氢气干预提高了HDL3的抗炎功能。
氢气干预对高胆固醇血症患者发生ASCVD（动脉粥样硬化）的风险评估
研究团队进行了氢气治疗在高胆固醇血症患者中，对动脉粥样硬化发展的风险评估。
如上图所示，通过氢气干预，10年期动脉粥样硬化风险（百分比）的趋势是降低的。
综上所述，研究团队得出结论，富氢水干预，能增加pre-β1-HDL水平，激活ABCA1依赖性胆固醇从外周巨噬细胞流出；同时改善其他HDL功能，包括防止LDL氧化、抑制ox-LDL诱导的单核细胞粘附到内皮细胞，保护内皮细胞免受ox-LDL诱导的细胞凋亡。此外，富氢水治疗可降低血浆胆固醇水平、血浆氧化应激和炎症状态。
因此，研究团队最终得出结论，口服富氢水可以预防或延缓高胆固醇血症和动脉粥样硬化的发生和展。
下图记录了所有试验参与者，试验前后血脂数据变化情况。
【临床试验-吸入氢气】
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的慢性肝病【15、16】，肥胖、2型糖尿病、高脂血症是诱发的主要原因。NAFLD传统上被认为是一种西方疾病，由于饮食习惯和久坐不动的生活方式，NAFLD的患病率一直在不断增加【17】。
然而，2017年发表的一项荟萃分析表明，NAFLD在亚洲的患病率约为25%，与西方国家相似，并且可能会继续增加【18】。NAFLD涵盖广泛的临床亚型组织学谱，包括单纯性脂肪变性（NAFL）和脂肪性肝炎（NASH）【19】。大约20%–30%的NAFL可进展为发生炎症和纤维化的 NASH，其中37%~41%的NASH患者发展为肝硬化【20、21】。目前没有FDA批准的药物可用，NAFLD很难治愈。虽然包括饮食调整、运动在内的生活方式干预被证明是有用的【22】，然而，迫切需要替代疗法来预防疾病进展。
分子氢被认为是肝脏稳态的内源性调节剂【23】。同时，自噬（即自噬性溶酶体大量增加，从而对细胞的损伤起一种保护作用）也被证实与体内平衡有关【24】。越来越多的证据表明，在包括脂质相关代谢紊乱在内的多种疾病的发病机制中，自噬失调是原因之一。
然而，分子氢的作用是否与NAFLD中的肝细胞自噬相关，尚未确定。在这项研究中，研究团队以随机、安慰剂对照的方式，检查了氢气/氧气吸入对43名NAFLD患者血脂水平、肝脏脂肪沉积的影响。
本研究是一项随机、安慰剂对照试验，于2016年5月至8月在山东省煤炭泰山疗养院和山东第一医科大学进行。患者共43名，年龄30-70岁，平均年龄54岁，按照1：1的比例，随机分为氢气组和安慰剂组。氢气组使用氢气发生器（66%氢气、34%氧气；3L/min），每天连续吸入1小时；安慰组使用外形相同的设备，吸入空气，同样为3L/min。试验共进行13周，
试验前后，分别抽取患者空腹静脉血，进行总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、甘油三酯（TG）和肝酶的检测；使用商业试剂盒进行血清MDA、SOD（Solarbio）、TNF-α、IL-6（Mlbio）定量检测；并通过肝脏超声检查（USG），来测量肝脂肪变性等级。
参与本次试验患者的基本情况
结果一：吸入氢气可减轻患者的NAFLD
为了测试氢气/氧气吸入是否调节血脂，研究团队分析了试验前后所有患者的血脂。
13周后，两组患者的TC和TG水平均无明显变化，但氢气组LDL-C在试验后明显下降。更重要的是，作为肝损伤指标的AST和ALT 在氢气/氧气组中降低，表明氢气吸入具有肝脏保护作用；同时，氢气组的氧化应激和炎症生物标志物显著降低（MDA、TNF-α、IL-6），表明氢气具有全身抗炎作用。
为了验证氢气吸入对肝脂肪变性的影响，研究团队进行了USG和CT扫描。氢气组的中度脂肪变性减轻，USG诊断和CTL/S值均得到改善。
如上表所示，经过干预，在氢气组中有77.8%的中度病例好转为轻度病例，而安慰剂组中这个比例只有38.5%。另一方面，安慰剂组中有15.4%的中度患者，发展为重度病例，而氢气组则没有这样的情况。
氢气组与安慰剂组肝脂肪变性≥30%（CTL/S < 0.8）患者试验前后脂肪变性分级CT比较
氢组和安慰剂组患者的代表性肝脏CT扫描
如上图所示，试验结束后，用后氢气组的CTL/S较安慰剂组有所改善，CT扫描结果与超声检查结果一致，说明氢气入减轻了患者的中度肝脂肪变性。
结果二：氢气通过促进自噬减少AML-12细胞中的脂质积累
为了探索氢氢降低肝脏脂质含量的机制，研究团队使用了FFA加载的肝细胞体外模型。在存在FFA或PA的情况下，将AML-12细胞保持在20%氢培养箱中，以评估氢对脂质积累的抑制作用。
结果显示，与AML-12细胞在e二氧化碳培养箱中培养的模拟组相比，氢处理细胞暴露于1mmol/LFFA和0.5mMPA时，细胞内 TG 显著降低；同时，当用0.2mmol/L FFA或0.2 mmol/L PA处理AML-12细胞时，没有观察到差异，这意味着氢气对低浓度脂质积累没有影响。
接下来，研究团队探索了氢处理与自噬之间的关联。包括LC3-II/LC3-I、Beclin1 和与FFA诱导的自噬的自噬相关蛋白5（ATG5）。
结果表明，当 AML-12 细胞暴露于 0.2 mmol/L FFA 时，氢气会轻微抑制自噬，而当细胞暴露于 1 mmol/L FFA 时，氢气会轻微促进自噬。氢气对 FFA 处理细胞自噬的影响并不显著。然而，当 AML-12 细胞暴露于 PA 时，自噬得到显著促进。
随后，研究团队应用经 0.5 mmol/L PA 处理的AML-12 细胞的 TEM ，来研究氢处理是否引起任何超微结构变化。
结果表明，AML-12 细胞用 0.5 mmol/L PA 孵育12小时后产生双层自噬体和一些自噬溶酶体，而氢处理的细胞产生更大和更多的自噬溶酶体，表明自噬得到促进。
最后，研究团队将巨自噬的特异性抑制剂 3-甲基腺嘌呤（3-MA） 添加到氢处理的细胞中，以确定氢对脂质积累的抑制作用是否依赖于自噬。
结果表明，通过添加3-MA可恢复细胞内TG，表明阻断自噬可逆转氢对脂质积累的抑制作用。最终，研究团队确认了，氢分子通过促进自噬，抑制AML-12细胞中的脂质积累。
该研究的亮点在于，有别于以往人群研究相对较多，该研究是第一份描述分子氢对肝细胞自噬影响的报告。
在NAFLD的药物治疗中，吡格列酮和维生素E研究最多。吡格列酮治疗可改善NASH的肝脂肪变性【25、26】，然而，也有副作用，包括体重增加、足部水肿、骨质流失和心力衰竭【26】。补充维生素E是治疗非肝硬化、非糖尿病 NASH 的一种选择【27】，但其副作用可能包括心血管事件导致的死亡、肝毒性和胆红素升高等【28、29】。在氢生物医学中，大多数临床试验未发现不良事件或副作用，这也与秦教授团体的研究一致【30】。
13周的干预，虽然比之前的报告更长，但仍然是一种短期治疗。对以下患者进行24周干预后的一项研究代谢综合征表明，在饮用富氢水的患者中发现胆固醇和葡萄糖水平降低，炎症和氧化还原稳态的生物标志物得到改善【31】。因此，延长干预可能会取得更好的改善。
综上所述，研究团队认为，分子氢对肝脏脂肪堆积具有抑制作用，并作为一种保护机制促进自噬。该研究结果为氢气治疗作为NAFLD的辅助治疗提供了证据。
【研究结论】
根据上面的动物实验、以及富氢水和吸入氢气干预试验，证明氢气可以作为一种新型调脂剂，有望用于预防/治疗动脉硬化，以及高血脂症引起的各种疾病（如非酒精性脂肪肝）。
在氢气的干预方式上，针对中老年人，建议日常采用饮用富氢水、吸入氢气治疗，并长期（3-6个月）坚持，可能会有更好效果。
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