尿中游离(非共轭)皮质醇测量是库欣综合征(CS)筛查和随访的基础。尽管它们的分析精度很高，但这些测量被广泛使用免疫分析法进行。液相色谱-质谱(LC-MS)的最新进展使分析方法的复杂性大大降低，这有助于将强大的诊断工具纳入常规临床实验室。除了高分析特异性使其成为最先进的类固醇激素定量技术外，LC-MS还允许同时分析不同的代谢物，从而提供可能对临床有帮助的额外信息。

液相色谱-高分辨率质谱(LC-HRMS)一直与定性分析和研究有关，而液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)一直与定量和常规分析有关。然而，目前可用的LC-HRMS仪器对小分子(包括类固醇)的灵敏度和定量性能与LC-MS/MS相当。此外，HRMS比分辨率较低的三重四极杆仪器提供更准确的质量。此外，目前的LC-HRMS允许同时进行敏感的定量和定性分析。因此，高分辨率全扫描采集允许非靶向化合物鉴定，这可能有助于鉴定临床相关的代谢物或药物。此外，代谢表型、生物标志物发现的数据挖掘和回顾性数据分析也为临床研究提供了优势。这些因素，加上良好的通用性和越来越高的价格，解释了临床和研究实验室对使用LC-HRMS开发分析方法越来越感兴趣。

本研究的目的是验证一种简单的常规LC-HRMS方法，同时定量尿液中皮质醇、可的松、6β-羟基皮质醇和18-羟基皮质醇的浓度。除了尿皮质醇测量在CS中的关键作用外，皮质醇/可的松比值(11β-羟基类固醇脱氢酶2 (11β hsd2)活性)是明显矿化皮质激素过量综合征的敏感标志物，可能有助于区分库欣病和异位ACTH产生。

6β-羟基皮质醇/皮质醇比值是广泛使用的CYP3A活性内源性标记物，18-羟基皮质醇水平可用于评估原发性高醛固酮增多症，特别是在其家族型诊断中。之前有验证过的LC-MS/MS方法用于测量尿液皮质醇和可的松，皮质醇和6β-羟基皮质醇，以及18-羟基皮质醇。最近，两种LC-HRMS尿液分析方法包括皮质醇、可的松和6β-羟基皮质醇。然而，据我们所知，Shackleton等人开发的GC-MS方法仍然是唯一经过验证的方法，包括皮质醇、可的松、6β-羟基皮质醇和18-羟基皮质醇。因此，本研究同时验证了基于Shackleton等人开发的GC-MS方法，并将其与LC-HRMS方法进行了比较。此外，我们用商业皮质醇免疫分析法评估了测量的皮质醇代谢物的交叉反应性，并在临床怀疑高皮质醇血症或CS随访的患者中使用LC-HRMS量化了四种类固醇的24小时尿排泄。

方法:本研究旨在验证一种简单的常规LC-HRMS同时定量人尿中皮质醇、可的松、6β-羟基皮质醇和18-羟基皮质醇的方法。此外，该研究还验证了相同类固醇的GC-MS方法，评估了它们与商用皮质醇免疫测定法的交叉反应性，并量化了临床怀疑或随访的高皮质醇患者24小时的尿排泄。

用GC-MS (A)和LC-HRMS (B)方法测定的人尿液中类固醇尖峰曲线与甲醇中相应曲线的比较。F:皮质醇，E:可的松，6βOHF: 6β羟基皮质醇，18OHF: 18-羟基皮质醇。从不同的甲醇样品中获得了4个重复，另外4个来自不同的血清来源

质量控制的日间准确度和不精确值以及尿液样本的日间不精确值(n = 5)。A:准确度。RSD:相对标准偏差。QC:质量控制

（A、B)评估不同浓度可的松、6β-羟基皮质醇(6βOHF)和18-羟基皮质醇(18OH)标准尿液皮质醇免疫分析的干扰。(C,D)在尿液样本中加入不同浓度的代谢物后，评估不同浓度的可的松和6β羟基皮质醇(6βOHF)对尿皮质醇免疫分析的干扰

与LC-HRMS方法相比，使用联络免疫法测量尿液中皮质醇的ing回归图(A)和Bland-Altman偏差图(B)

LC-HRMS测量皮质醇和可的松(上)、6β-羟基皮质醇(中)和18-羟基皮质醇(下)在整个范围内的线性相关和回归，皮质醇< 200µg/天和皮质醇> 200µg/天