循环游离DNA（cfDNA）已被广泛用于癌症检测和监测研究。但早期癌症患者的血浆中肿瘤衍生cfDNA片段浓度较低，且真实的基因组信号被生物和技术噪声稀释，这些都是液体活检面临的挑战。

现有的液体活检方法主要集中在细胞游离核DNA分析，对非核DNA在液体活检中的应用潜力仍然未知，特别是线粒体DNA（mtDNA）。此前有研究使用PCR方法在动物模型的血浆中发现了肿瘤来源的mtDNA，但迄今为止，尚未对血浆mtDNA作为单独或联合液体活检方法在多种恶性肿瘤中的应用进行系统评估。

那么血浆中mtDNA变化是否可以反映癌症的出现？利用细胞游离mtDNA能提高癌症的检测吗？

来自荷兰阿姆斯特丹自由大学及澳大利亚墨尔本大学的联合研究团队在Genome Biology发表了题为“The landscape of cell-free mitochondrial DNA in liquid biopsy for cancer detection”的文章。研究人员通过对来自健康个体和癌症患者的血浆样本（涵盖12种癌症类型）进行全基因组测序（WGS），对血浆mtDNA分数（fraction）进行分类。与健康个体相比，胆管癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌或前列腺癌患者的mtDNA分数增加，其他癌症类型的患者中几乎没有检测到mtDNA分数的增加。血浆中mtDNA分数与基于体细胞突变和/或拷贝数畸变的肿瘤cfDNA分数相关。一些患者中肿瘤衍生的cfDNA没有明显增加，但mtDNA分数也有升高。单独使用拷贝数改变时，预测模型的曲线下面积（AUC）为0.73，将mtDNA和拷贝数整合分析后AUC增加到0.81。    

文章发表在Genome Biology

液体活检识别正常和肿瘤衍生的mtDNA

研究人员需要评估的第一个问题是：在液体活检样本中是否可以检测到肿瘤来源的mtDNA？

由于线粒体基因组中突变的数量庞大且多样性高，使用人类样本进行这一验证具有挑战性。因此，研究人员选择了腹腔内移植了人结直肠癌细胞系的13只小鼠，对其血浆进行了3×覆盖率的WGS（图1）。将所得测序数据分为小鼠来源（正常）和人类来源（肿瘤）后，评估了癌细胞mtDNA。结果显示，在所有样本中均检测到肿瘤来源的mtDNA，腹膜癌指数（PCI）的增加表明肿瘤负荷的增加（图1B），并且肿瘤核reads和肿瘤mtDNA reads之间具有相关性。肿瘤来源mtDNA的reads计数（中位数=124）低于正常来源的mtDNA（中位数=2717）。以上结果表明，与细胞核的测序数据一样，循环mtDNA的比例及其片段特征有可能成为探索人类癌症的潜在标志物。

图1. 使用动物模型测定肿瘤衍生的mtDNA在循环中的特异性贡献。

mtDNA的丰度取决于临床状态和癌症类型

研究人员对655名癌症患者和200名健康个体的855份血浆样本中的mtDNA分子比例进行了WGS分析，覆盖深度为0.1×到30×（图2）。样本来自三个采集中心（澳大利亚-A、英国-U、荷兰-N），队列A癌症类型为黑素瘤和乳腺癌，队列N为肺癌，队列U为乳腺癌、卵巢癌、肾癌、胶质瘤等（图2A-B）。mtDNA分数定义为，过滤后映射到线粒体基因组的reads数量与测序reads总数的比值。

图2. 研究中血浆样本的纳入情况。

液体活检中mtDNA的总体中位丰度为0.0032%（范围：0.0017-0.0047%）。与U队列和A队列中的健康对照相比，癌症患者血浆中mtDNA的比例显著增加（图3A），N队列与这两组不同，表明在不同的癌症类型中mtDNA分数有所不同。在队列A和N中，血浆中的mtDNA分数在很大程度上没有因癌症分期而不同（图3B-C）。但晚期黑色素瘤例外，与早期阶段相比，晚期mtDNA分数显著下降。在同一数据集的健康个体中，mtDNA分数不受年龄和性别的影响。此外，肿瘤血浆mtDNA片段大小分布模式为84bp，健康个体血浆mtDNA片段为86bp。

考虑到不同样本采集中心的健康样本之间存在差异，研究人员使用队列U（一项单一的泛癌研究）比较了不同癌症类型。结果表明，不同癌症之间的mtDNA分数存在显著差异，这与之前的结果一致（图3D）。与健康个体相比，胆管癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌和前列腺癌中血浆mtDNA分数显著增加，乳腺癌、肺癌和卵巢癌的mtDNA分数没有增加。总的来说，mtDNA分数不仅受有无癌症的影响，还与癌症类型有关。   

图3. 按癌症分期和类型分类的临床血浆样本中mtDNA的丰度。

血浆mtDNA分数与肿瘤分数相关

血浆mtDNA分数与通过拷贝数畸变（ichorCNA）和/或突变（ddPCR或靶向测序）估计的cfDNA肿瘤分数相关。在10个评估队列中有6个mtDNA分数和肿瘤分数呈正相关（图4A）。结直肠癌的mtDNA比例与肿瘤分数之间的相关性最高。肾癌和胶质母细胞瘤在血浆中检测到的体细胞拷贝数改变（SCNA）率较低，可能导致ichorCNA检测到的mtDNA分数和肿瘤分数之间不存在相关性（这些病例没有可用的突变等位基因分数数据）。对于在多个临床中心均有收集的乳腺癌病例，均显示与ichorCNA估计的肿瘤分数呈显著正相关，对于黑色素瘤病例，肿瘤分数呈仅在队列U中呈显著正相关。

图4. 血浆中mtDNA分数与肿瘤分数的关系。

在队列U的单一泛癌数据集中，mtDNA水平同样随肿瘤分数增加(图4B-D）。此外，与健康对照相比，被归类为ichorCNA检测不到（肿瘤分数<3%）的样本mtDNA分数也显著增加。循环mtDNA传递的信号可能与除了ctDNA释放之外的其他生物学特征有关，例如代谢活性，这解释了观察到的中度相关性。由于mtDNA信号在缺乏可检测的SCNA时升高，研究团队认为使用mtDNA分数进行分类可能有助于癌症检测。

血浆mtDNA提高癌症检测性能

最后，研究人员对855个血浆样本使用了监督学习方法（图5A），在数据的子集上训练随机森林分类器，用于构建分类模型，包括单独使用mtDNA分数和ichorCNA肿瘤分数以及同时使用两种特征构建的三个模型。测试集的性能是通过50次迭代的准确性和曲线下面积（AUC）来评估的。

结果显示，使用mtDNA分数作为唯一特征的模型平均准确度为0.6，平均AUC为0.65。使用ichorCNA肿瘤分数作为预测特征的模型的总体性能更高，平均AUC为0.73。将ichorCNA肿瘤分数和mtDNA分数相结合显著提高了分类性能，准确度从0.69增加到0.73，平均AUC从0.73增加到0.82（图5B-D）。

图5. 通过机器学习利用mtDNA信号来增强癌症检测。

综上所述，研究团队描述了867例血浆样本的大型泛癌液体活检队列中循环mtDNA的特征，证明了mtDNA可以通过低覆盖率WGS检测，并揭示了mtDNA水平如何受TMB、临床分期和癌症类型的影响。mtDNA水平仅与患者血浆中肿瘤衍生的cfDNA部分相关。重要的是，在一些情况下，当cfDNA分析不能提供信息时，mtDNA可以提供信息。mtDNA分析有可能提供反映癌症特征的新信息，而ctDNA目前忽略了这些特征，例如区分癌症细胞的侵袭性或其代谢改变。通过将WGS获得的mtDNA信号与ctDNA的其他肿瘤衍生信号（例如突变、拷贝数异常或甲基化）相结合，可提供一种新的策略来提高癌症液体活检性能。     

论文原文：

van der Pol, Y., Moldovan, N., Ramaker, J. et al. The landscape of cell-free mitochondrial DNA in liquid biopsy for cancer detection. Genome Biol 24, 229 (2023). https://doi.org/10.1186/s13059-023-03074-w