尽管口腔肿瘤类器官已经彻底改变了癌症病因学和治疗的观点，但目前的细胞培养方法在构建具有体内样复杂性的肿瘤类器官方面仍然存在挑战，特别是缺乏肿瘤组织的原生特征，导致体内反应的结果不可预测。因此，南京大学宁兴海教授团队/南京医科大学附属第四人民医院傅振团队开发了一种联合生物正交纳米工程策略动态构建体外三维口腔肿瘤类器官的策略，用于更精确地模拟口腔肿瘤组织。在这一过程中，将细胞经叠氮修饰甘露糖（Ac4ManNAz）代谢后，在细胞膜表面表达叠氮基团，获得糖代谢工程化的细胞，然后与多价点击配体(ClickRod)反应，从而快速构建口腔肿瘤类器官。我们发现这种策略可以有效地将肿瘤细胞和肿瘤相关免疫细胞组装在一起，构建异质性口腔肿瘤类器官。而且，ClickRod表现出良好的光热活性，从而可以远程精确控制细胞活性，塑造口腔肿瘤类器官生理微环境，从而形成了原始肿瘤的动态特征，如细胞组织的异质性、多能性、不同的成熟水平和生理梯度。重要的是，BONE不仅为研究肿瘤发生和治疗反应提供了一个有前景的平台，而且改善了轻度光刺激下皮下异种移植模型的建立，从而显著推进了癌症研究。该研究以题为“An integrative bioorthogonal nanoengineering strategy for dynamically constructing heterogenous tumor spheroids”的论文发表在《Advanced Materials》上。

【点击试剂ClickRod的制备与表征】

由于透明质酸（HA）是肿瘤细胞外基质（extracellular matrix, ECM)的重要组成成分，可以模拟体内肿瘤组织的微环境成分，促进肿瘤生长和细胞间相互作用。另外，金纳米棒（AuNRs）具有近红外区光吸收热转换效率高、生物相容性好、载药能力强、易修饰等独特优势，使其成为一种良好的光热剂。因此，该研究构建了一种由透明质酸修饰金纳米棒（AuNRs）的纳米点击试剂ClickRod，不仅显示出良好的光热稳定性，而且具有高度的生物安全性，可以用于后续体外模型构建。

图1. 点击试剂ClickRod的制备与表征。

【细胞工程化】

糖代谢工程和生物正交点击化学的结合为活细胞工程提供了一种很有前途的方法，因为它对生物正交反应伙伴的高反应性和对生物分子的惰性，赋予了在不影响细胞功能的情况下选择性标记细胞的能力。考虑到肿瘤组织中大量存在的肿瘤相关巨噬细胞，我们对人舌鳞状上皮癌细胞（Cal-27）和肿瘤相关巨噬细胞（TDM）进行工程化改造，细胞经叠氮修饰甘露糖（Ac4ManNAz）代谢后，在细胞膜表面表达叠氮基团，获得糖代谢工程化的两种细胞，随后通过点击反应将ClickRod交联到细胞膜表面。结果显示，两种细胞均可以在细胞膜表面修饰叠氮基团，对细胞活性无影响。在ClickRod修饰后进行温和光热刺激，可以显著促进细胞增殖活性，增殖期细胞增多，增殖相关基因表达量升高，且巨噬细胞呈现M2极化特性。

图2. 细胞工程化及光热促进细胞活性表征。

【动态异质性瘤球构建和表征】

基于以上ClickRod对细胞工程化和光热促进细胞活性的结果，我们在3D培养体系中对两种细胞进行交联，动态构建3D体外口腔肿瘤类器官。以传统液体覆盖法为对照，化学交联形成的初步瘤球模型更规整，粘附细胞更多。在光热刺激下，动态瘤球生长速度更快，成瘤率更高，其中所含巨噬细胞量更多，细胞代谢效率更快。通过共聚焦显微镜观察瘤球组成，可以看出交联形成的瘤球广泛分布着肿瘤细胞和巨噬细胞，成功形成细胞异质性口腔肿瘤类器官。

图3. 动态口腔肿瘤类器官的构建和表征。

【3D口腔肿瘤类器官的理化性质表征】

除了细胞组成外，肿瘤的理化性质是实体瘤的重要特征，对肿瘤生长、上皮-间质转化、细胞转移等起到关键作用。与传统的二维细胞相比，3D口腔肿瘤类器官能够更精准地再现实体肿瘤的核心特性和结构，包括坏死核心、静止细胞内层和最外层的增殖细胞，以及肿瘤的干性、缺氧、应激等特征。通过Calcein-AM/PI染色和共聚焦成像，显示动态口腔肿瘤类器官模型呈现明显的内外层细胞活性，内层细胞凋亡，外层细胞增殖。另外，动态口腔肿瘤类器官模型的乏氧水平更高、应激水平更强，细胞

图4. 动态异质性3D口腔肿瘤类器官的理化性质表征。模型机械强度更大，巨噬细胞呈现M2极化。

【体内移植模型】

除了体外口腔肿瘤类器官外，肿瘤异种移植模型是癌症治疗的主要临床前筛选平台。重要的是，肿瘤异种移植模型的体内反应不能准确地与患者反应相关联。因此，需要新的移植模型来促进癌症病理生理学和临床前药物筛选的新发现。我们将动态口腔肿瘤类器官经皮下移植后进行温和光热刺激，以此来构建体内动态口腔肿瘤类器官。结果显示，动态模型组的肿瘤成瘤率和肿瘤生长速度均是最优的，肿瘤组织中血管生成较多，应激反应水平升高，对药物的耐受性增强。是一种理想的体内口腔癌模型。

【结语】

本研究开发了一种新型生物正交纳米工程策略(BONE)用于动态构建光活性口腔肿瘤类器官。不仅实现了口腔癌细胞和免疫细胞等多种细胞类型的组装，而且能够在远程光刺激下操纵细胞命运。这种协同作用极大地推动了口腔肿瘤类器官的发展。从细胞组成、组织结构、微环境、生理梯度等各个方面，动态口腔肿瘤类器官均显示出与体内组织相似的肿瘤样特征，使其成为体内外药物筛选的宝贵工具，不仅加深了我们对癌症生物学的理解，而且为癌症治疗探索开辟了新的领域。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37801656/