静脉血栓栓塞症(VTE)是指深静脉血栓形成的一种常见疾病。VTE的发病率高出4 ~ 12倍，已被广泛认为是所有癌症患者中排名第一的致死性并发症，占癌症总死亡人数的近9%。虽然血栓的分离和移动可能会导致猝死等严重后果，但大多数VTE病例无症状，容易被忽视。

基于此，中科院理化技术研究所王树涛研究员、孟靖昕研究员和首都医科大学张澍田教授合作提出了一种由TiO₂纳米花(TiNFs)组成的快速、易操作、高特异性和高灵敏度的促凝血细胞外囊泡条形码(PEVB)检测方法，用于可视化评估癌症患者的VTE风险。通过TiO₂-磷脂分子相互作用和TiNFs与EV之间拓扑相互作用的协同作用，TiNFs表现出快速的无标记EV捕获能力。在普通血浆样本中，通过将基于TiNFs的EV捕获和原位EV促凝能力检测与机器学习辅助的临床数据分析相结合，PEVB检测可以评估潜在的VTE风险。通过对167例癌症患者的筛查，我们证明了PEVB检测在VTE风险评估中的可行性，以及高特异性(97.1%)和高敏感性(96.8%)，完全超过了非特异性和后循环的传统VTE检测。

总之，我们提出了一个TiNFs平台，可以高度准确和及时地诊断癌症患者的VTE。相关工作以“Machine-Learning-Assisted Procoagulant Extracellular Vesicle Barcode Assay toward High-Performance Evaluation of ThrombosisInduced Death Risk in Cancer Patients”发表在《ACS NANO》。

示意图1. 准确评价静脉血栓栓塞(VTE)的PEVB法原理图设计

精确评价VTE的PEVB法设计

为了准确评估促凝血EVs引起的癌症患者VTE风险升高，并防止不明确的诊断，我们开发了一种基于二氧化钛纳米花(TiNFs)的PEVB检测(示意图1)。PEVB检测实现了三个关键过程:

(i)基于TiNFs的EV快速捕获;

(ii)易于操作的通过计数阳性条形码数获得条形码评分的原位EV促凝能力测试;

(iii)机器学习辅助临床数据分析，用于准确的VTE风险评估。

图1. TiNFs上的EV捕获能力

TiNFs上的快速EV捕获

研究者通过将500 μL EV悬浮液滴到铺有TiNFs的55 mm × 25 mm玻璃载玻片上，验证了基于TiNFs的无标记EV捕获的可行性。如图1a所示，通过TiO₂ -磷脂相互作用和拓扑相互作用，大量的EVs(用粉红色标出)被捕获到尖端之间的陷阱和相邻的TiNFs纳米金属的间隙上。应用20个FAM标记的人工模型EV 21，优化EV捕获的孵育时间。在TiNFs上捕获的EVs的荧光强度最初随着孵育时间的增加而增加，在约20分钟后达到平台期，进一步确定捕获时间为30分钟(图1b)。

图2. 肿瘤来源的EVs促凝血能力的评估

肿瘤来源的EVs促凝血能力的评估

为了评估TEV促进血凝的效果，我们在铺有LTiNFs的10 mm × 10 mm玻片上测定了EV的促凝能力。简单地说，将50 μL HCT-15细胞衍生的tEV悬液在LTiNFs上孵育30 min，然后用PBS洗涤。随后，将20 μL模拟血和20 μL凝血酶稀释液(人工凝血指示剂)的混合物滴至这些LTiNFs上，触发血凝反应，从而使血细胞缠结凝固。我们绘制了一系列凝血酶浓度(1.8 ~ 6.6 ng/ mL)和tEV浓度(0 ~ 2.1 × 10 7 EVs/mL)的凝血水平，从而生成相图(图2a)。热图由三次独立试验的平均灰度值组成，表明随着tEV浓度的升高，促凝能力升高，从而随着凝血酶阈值的降低，促进血液凝固(图2b)。

图3. 肿瘤患者样本EV促凝能力的评价

癌症患者EV促凝能力的评估

利用广泛报道的具有直接观察和可视化结果的条形码系统，研究者通过在疏水亲水性图案玻璃衬底上生长LTiNFs来制备PEVB芯片 (图3a)。PEVB芯片由用于EV捕获的亲水性ltinf的条形码区域(白色，20.0 × 4.0 mm)和疏水性区间(1.75 mm)组成，以防止相邻条形码的干扰(图3b, 3c)。多重EV促凝能力试验:将患者血浆20 μL加载到每个条形码区域捕获EV，孵育30 min后加入人工凝血指标(血液悬液、血浆标准品、凝血酶的混合物，9次滴定从6.0 ng/mL降至1.2 ng/mL，间隔0.6 ng/mL)。

图4. 采用机器学习辅助VTE风险评估

机器学习辅助的VTE风险评估

与条形码评分和d-二聚体水平的简单组合相比，集成了条形码评分、d -二聚体和诊断的机器学习模型(logistic、LASSO、SVM、Adaboost和随机森林)均可明显区分VTE患者和非VTE患者(图4a)。在所有算法中，Adaboost获得了最好的AUC值0.993，同时表现出高特异性(97.1%)、高准确性(97.0%)和高敏感性(96.8%)(图4b)。

相比之下，使用250 ng/mL的临床临界值时，只有d -二聚体表现出低特异性(44.8%)、低准确性(53.2%)和高灵敏度(90.3%)，而使用通过最大准确度值确定的临界值5时，PEVB检测法表现出低特异性(75.0%)、低准确性(74.3%)和低灵敏度(70.9%)。这些结果表明，我们可以通过一个简单可行的平台实现高性能的VTE评估。

【小结】

PEVB检测可快速、直观地反映肿瘤患者发生VTE的风险，无需经过特殊培训的普通技术人员即可操作。我们相信，该方法具有良好的性能，可以很容易地应用于临床实践，作为一种评估VTE风险的无创、方便、常规、高度特异和抢先的方法，尤其是对于低收入和中等收入国家。

原文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.3c04615.