牙周炎是一种常见的慢性炎症，其特征是影响牙齿周围组织的破坏性炎症反应，包括牙龈炎、牙周袋形成和牙周骨质流失，最终导致牙齿失去支撑和脱落。最近的研究表明，牙周炎影响全球约50%的成年人，估计严重牙周炎的患病率在10-15%之间。包括牙菌斑、牙垢、创伤性咬合、食物填充物、不良修复和口腔呼吸，可导致牙周炎的发展。未能及时治疗牙龈炎可导致炎症从牙龈扩散到牙周组织的更深层、牙槽骨和牙骨，最终导致牙周炎。在疾病的早期阶段，患者可能没有任何明显的症状，继发性牙龈出血或口臭是最常见的。

然而，当患者出现症状时，疾病已经发展到更严重的阶段，并可能导致牙齿脱落，使其成为成人牙齿脱落的主要原因。目前，牙周炎的诊断依赖于放射检查，探测袋深度，分析出血和CAL(临床附着丧失)。然而，这些工具有局限性，可能在早期识别和诊断牙周炎方面存在滞后。

氧化应激(OS)是一种以体内抗氧化和氧化作用不平衡为特征的状态，导致蛋白酶的分泌增强，氧化中间体的产生，氧化倾向，中性粒细胞的炎症浸润，主要是活性氧(ROS。Kanzaki等人报道牙周炎是一种病理状态，氧化应激在组织降解中起直接和间接的作用。防御系统和氧化应激之间的平衡对于维持健康的牙周组织至关重要。在牙周炎患者中，由牙周炎引起的氧化应激可以促进促炎途径，包括破骨细胞的产生，导致骨质流失。ROS可以作为破骨细胞途径中的细胞内信号分子，间接促进牙周组织破坏的恶化。

再者，血浆、唾液和牙龈沟氧化应激标志物在牙周炎患者中更高。牙周炎的发生是一个涉及多基因及其产物的复杂过程，单基因标记往往不能充分反映牙周炎的发病机制，对疾病的诊断敏感性较差。因此，有必要开发基于氧化应激生物标志物的新型预测模型，用于疾病的早期筛查和诊断，这将在临床实践中具有重要价值。

自下一代测序出现以来，机器学习已被广泛用于识别基因表达模式与疾病之间的关系。人工智能(AI)已成为评估牙周炎风险和诊断牙周炎(从早期到中度和重度)的有力工具。通过利用先进的机器学习和深度学习算法，人工智能可以仔细检查大量的临床数据，包括患者的口腔健康状况、口腔卫生习惯和生活方式，以提供精确的风险评估和疾病诊断。此外，人工智能可以帮助牙医进行图像分析以进行诊断，例如评估牙周袋深度和骨质流失。这有助于早期发现中度和重度牙周炎，并有助于制定适当的治疗计划，有效防止疾病进一步发展。

鉴于牙周炎的广泛流行和对口腔健康和生活质量的重大影响，我们的研究旨在通过整合转录组测序，机器学习算法和单细胞测序技术来阐明潜在的分子机制并构建精确的诊断模型。通过最先进的Nomogram和Decision curve分析，我们严格评估了该模型的有效性，并成功地将牙周炎患者分为两个不同的亚型，即C1和C2。对这些亚型的免疫浸润的深入分析揭示了这些亚型的差异和免疫机制，为理解牙周炎的发病机制提供了重要的见解。

此外，通过利用单细胞测序数据，我们深入研究了牙周炎微环境中复杂的细胞通讯和模拟基因表达，揭示了细胞水平上疾病进展的新见解。我们的研究结果有望为牙周炎的个性化治疗和管理策略的发展提供强有力的学术支持，最终改善患者的预后，增强口腔健康。

图1 流程图总结了本研究的主要设计

图2  牙周炎患者中OSRGs的差异表达。（A，B）PD和对照样品的PCA。（C） DE OSG热图。（D） DE OSG的火山图。（E） 牙周炎样本中26个DE PRG的相关性红色，正相关；蓝色，负相关。（F） 使用基因本体论（GO）富集分析对DE OSG进行分析。x轴表示与一个术语相关的基因数量，y轴表示通路术语。每个术语的qvalue根据图例进行着色。bp，生物过程；cc，细胞成分；mf，分子功能。（G） 由上述基因富集的主要KEGG途径。使用wilcox.test方法检验差异的显著性，获得的p值表示为“***”<0.001、“**”<0.01、“*”<0.05

图3  筛选建模基因的三种机器学习算法。（A） LASSO模型中调谐参数选择的十倍交叉验证。每条曲线对应一个基因。（B） 拉索系数剖面。实线表示部分似然偏差SE。虚线在最优l处绘制。（C）通过支持向量机递归特征消除（SVM-RFE）进行生物标志物特征基因表达验证。（D） 随机林关系中的树数与错误率。（E） 根据基因的相对重要性对其进行排序。（F） Venn图显示了LASSO、随机森林和SVM-RFE算法共享的特征基因

图4 评估OSRGs的诊断功效。（A） 基于特征基因表达的诺模图。（B） 用于验证列线图的校准图。（C） DCA曲线证明了所构建的模型在IL-1b、TXN和标志基因的验证中的标准化净效益。预测（D）训练集（GSE16134、GSE23586）和（E）测试集（GSE1 0334）中牙周炎诊断益处的模型ROC曲线。（F–H）ROC曲线，用于估计特征基因的诊断性能）（IL-1b、TXN、CASP3）

图5 模型基因的相互作用分析和富集分析。（A–C）GSEA识别特征基因中涉及的信号通路。（A） IL-1b，（B）TXN，（C）CASP3，（D）表征的基因共表达网络。（E） 共表达基因的GO分析。（F） 共表达基因的KEGG分析

图6 基于OSRGs的牙周炎氧化应激亚型的构建。（A） 当k=2时的一致性矩阵热图。（B） k=29时的一致CDF。（C） 两个氧化应激分型样本的主成分分析。（D） 不同亚型的三个模型基因之间差异的热图。

（E） 通过ssGSEA评估不同亚型的样品的氧化应激表达。（F） 不同氧化应激亚型之间差异表达的箱形图。（G，H）分别通过GSVA和fGSEA对不同氧化应激亚型中差异表达基因的通路富集分析和条形图表示。“***”表示P＜0.0001

图7 具有各种亚型氧化应激的样品中免疫细胞浸润和免疫途径富集。（A） 高和低氧化应激亚型之间免疫细胞浸润的差异。（B） 免疫细胞和免疫功能ssGSEA评分介于高和低氧化应激亚型之间。（C） 生物标志物与免疫细胞浸润的Spearman相关系数分析。（D） 生物标志物与免疫功能的Spearman相关系数分析。使用wilcox.test方法检验差异的显著性，获得的p值表示为“***”<0.001、“**”<0.01、“*”<0.05

图8 伪时间序列分析。（A） 单核细胞亚群聚类和降维。（B） 子填充单元格注释结果。

（C） 细胞分化程度的伪时间测量，正常组疾病组的分布，以及十三个分支的分化轨迹。（D） 十三支山脉图按建议的时间顺序区分

（E） BEAM氧化应激基因表达的热图与所提出的时间序列。（F） 三个基因的表达分别随拟定时间的变化