“活下来，就仍然拥有希望！”这是一名杜兴氏肌营养不良症（DMD）患者说过的话。

　　DMD是由于在X染色体上编码抗肌萎缩蛋白的基因上出现突变而导致的罕见遗传病。抗肌萎缩蛋白的缺失或缺陷，导致肌肉在收缩过程中出现慢性损伤，炎症发作，影响肌肉的再生。最终，肌肉被瘢痕组织或者脂肪代替。患者的肌无力症状在2-3岁时就很明显，随着肌肉组织和功能的不断丢失，在12岁时通常只能靠轮椅行动，20岁时需要辅助呼吸，在30-40岁时因为呼吸或心力衰竭而早夭。

　　目前，大部分现有疗法只能缓解疾病症状，却不能针对疾病根源，DMD患者的希望在于创新疗法的开发。而今天的新闻却不是那么令人喜悦——开发DMD创新疗法的Sarepta Therapeutics公司宣布收到了FDA对其DMD疗法golodirsen的完整回复信（CRL）。由于对与静脉输液接口（intravenous infusion ports）相关的感染和golodirsen在临床前动物模型中表现出的肾脏毒性的疑虑，FDA没有加速批准golodirsen上市。

　　除了golodirsen以外，多家公司和研究机构也在针对DMD发病的根本原因——抗肌萎缩蛋白的缺失，开发创新疗法。下面，我们来看一看这些疗法的最新进展。

▲治疗DMD的外显子跳跃和基因组编辑疗法（图片来源：参考资料[4]）

　　外显子跳跃疗法

　　外显子跳跃疗法通过使用RNA或者DNA片段，让表达抗肌萎缩蛋白的RNA前体在剪接时跳过特定外显子。因为DMD患者的基因突变会造成阅读框（reading frame）移动，从而生成没有功能的抗肌萎缩蛋白。而外显子跳跃疗法去除了基因突变带来的阅读框移动，生成的抗肌萎缩蛋白虽然比正常蛋白短一些，但是仍然具有抗肌萎缩蛋白的部分功能。Sarepta公司的golodirsen就是一款外显子跳跃疗法，该公司开发的eteplirsen已经获得FDA批准上市。

　　除了Sarepta以外，Wave Life Sciences，第一三共（Daiichi Sankyo），和NS Pharma都在开发不同的外显子跳跃疗法。其中Sarepta公司的casimersen和NS Pharma公司的viltolarsen有望今年递交监管申请。

　　外显子跳跃疗法的局限性在于它是针对抗肌萎缩蛋白基因上特定基因突变而开发的疗法。因此，只有在这些区域出现基因突变的DMD患者才适合使用这些疗法。而且，目前外显子跳跃疗法生成的抗肌萎缩蛋白水平并不是很高，以golodirsen为例，虽然接受治疗的DMD患者抗肌萎缩蛋白表的水平是基线的16倍，但是也只达到正常水平的1%左右。提高外显子跳跃疗法生成的抗肌萎缩蛋白水平是提高这一疗法疗效的关键。

　　因为DMD患者全身的肌肉组织都需要接受治疗，因此外显子跳跃疗法需要通过全身性给药的方式对患者进行治疗。目前这一领域的研发重心之一是如何提高输入到患者体内的RNA/DNA片段靶向递送到肌肉的能力。以Sarepta公司的SRP-5051为例，这款外显子跳跃疗法在已经获批的eteplirsen上面偶联了靶向肌肉组织的多肽，从而提高了eteplirsen向肌肉组织递送的能力。

▲Sarepta公司提高外显子跳跃疗法效果的策略（图片来源：参考资料[3]）

　　基因疗法

　　另一类提高抗肌萎缩蛋白水平的疗法是基因疗法。这种方法将表达抗肌萎缩蛋白的转基因包装在AAV病毒载体中，然后将这些病毒注入患者体内。它们通过转染患者的肌肉细胞，让肌肉生成具有部分抗肌萎缩蛋白功能的重组蛋白。基因疗法的优势在于，它可以对携带任何类型DMD基因突变的患者生效。以AAV病毒作为载体的基因疗法高效转染肌肉组织的能力已经得到了证实。而且，基因疗法理论上可以让患者接受一次治疗之后，获得长期持久的改善，而上面提到的外显子跳跃疗法需要患者长期不断接受治疗。

　　然而，DMD基因是人类基因组中最大的基因之一，而递送基因疗法的AAV病毒载体能够容纳的基因长度有限，因此，目前包装进入AAV载体的DMD转基因通常编码的是称为“微抗肌萎缩蛋白”的精简版抗肌萎缩蛋白。这种重组蛋白保留了抗肌萎缩蛋白最关键的N端和C端蛋白结合域，但是删除了蛋白中间的大量血影蛋白样重复（spectrin-like repeats）。微抗肌萎缩蛋白只能弥补全长抗肌萎缩蛋白的部分功能。

▲全长抗肌萎缩蛋白（a）和基因疗法表达的几种微抗肌萎缩蛋白（b）（图片来源：参考资料[4]）

　　基于AAV载体的基因疗法需要面对的另一个挑战是很多患者体内已经存在对AAV病毒载体的免疫力。这会导致基因疗法还未能生效，就被患者自身的免疫系统清除。而且，在接受基因疗法后患者体内也会产生免疫反应，这意味着如果基因疗法在几年后失效，他们无法再度接受同一疗法的治疗。这是所有基于AAV载体的基因疗法需要解决的挑战。

　　目前，Sarepta公司的研发管线中也有一款名为SRP-9001的基因疗法。这一疗法使用的是从非人灵长类动物中分离出的AAVrh74载体，它的优点是能够在肌肉中引起转基因的强力表达，不会穿过血脑屏障进入中枢神经系统。而且，较少患者体内存在针对这一病毒载体的免疫力。SRP-9001基因疗法由MHCK7启动子驱动转基因的表达。这款启动子不但能够在骨骼肌、心肌和膈肌中驱动转基因表达，而且尤其增强了转基因在心脏中的表达。

▲AAVrh74病毒载体（图片来源：参考资料[5]）

　　除了Sarepta公司以外，辉瑞（Pfizer）公司最近公布了基于AAV9病毒载体的DMD基因疗法的1b期临床试验结果，并且计划在2020年开展3期临床试验。而Solid Biosciences公司的DMD基因疗法SGT-001最近也获得FDA放行，继续进行临床试验。

　　基因组编辑疗法

　　多家学术研究机构已经使用基于CRISPR的基因编辑技术，开发治疗DMD的基因编辑疗法。这类疗法目前还处于临床前实验阶段。它与外显子跳跃疗法有些类似，利用CRISPR基因编辑技术在患者DMD基因上切除包含基因突变的特定外显子，从而消除基因突变对抗肌萎缩蛋白生成的影响。与外显子跳跃疗法相比，它的优势在于永久性改变了患者DMD基因的结构，因此理论上只需要一次治疗，就可以让患者终身受益。今年杜克大学（Duke）研究团队在Nature Medicine杂志上发表的研究表明，在小鼠模型中，治疗DMD的基因编辑疗法在一年之后仍然可以维持表达抗肌萎缩蛋白的效果。

　　基因组编辑疗法同样需要使用AAV病毒载体递送，因此同样需要克服对AAV病毒载体的免疫力的挑战。而基因组编辑疗法面对的独特挑战在于CRISPR基因编辑系统的“脱靶效应”。由于DMD患者需要接受全身性疗法，避免CRISPR基因编辑系统的“脱靶效应”变得非常关键。

　　通读终止密码子（Stop Codon Readthrough）疗法

　　在大约13%的DMD患者中，基因突变导致终止密码子的出现，这种基因突变不会造成阅读框的改变，而是导致蛋白合成过早终止，生成没有功能的抗肌萎缩蛋白。

　　有些化合物通过与终止密码子相结合，可以让负责转译RNA的核糖体在读到终止密码子的地方添加一个氨基酸，而不是停止转译过程。通过高通量筛选发现的ataluren在动物实验中能够提高抗肌萎缩蛋白表达水平，并且具有相对良好的安全性和耐受性。这款药物已经在2014年获得欧盟有条件批准，商品名为Translarna。然而，在随后进行的验证性3期临床试验中，ataluren没有达到试验的主要终点。目前，ataluren在新的验证性3期临床试验中接受检验。

　　通读终止密码子疗法的局限性在于，它只能治疗产生终止密码子的DMD基因突变。

　　结语

　　在收到FDA的CRL之后，Sarepta公司总裁兼首席执行官Doug Ingram先生表示，将尽快与FDA会晤，全面解决CRL中提出的疑虑，并且寻找尽快批准golodirsen上市的监管通路，因为：“患者们等不及了！”

　　诚然，开发有效DMD疗法的道路上挑战众多，挫折在所难免，我们期待研发人员能够砥砺前行，早日将患者们期盼的希望交到他们手中。

　　参考资料：

　　[1] Sarepta Therapeutics Receives Complete Response Letter from the US Food and Drug Administration for Golodirsen New Drug Application. Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-therapeutics-receives-complete-response-letter-us-food

　　[2] Sarepta Announces FDA Acceptance of Golodirsen (SRP-4053) New Drug Application for Patients with Duchenne Muscular Dystrophy Amenable to Skipping Exon 53. Retrieved August 15, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/news-releases/news-release-details/sarepta-announces-fda-acceptance-golodirsen-srp-4053-new-drug

　　[3] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (RNA therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/33df8d49-8c3d-4a88-8717-12723b4a0750

　　[4] Verhaart and Artsma-Rus. (2019). Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy. Nature Reviews Neurology, https://doi.org/10.1038/s41582-019-0203-3

　　[5] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (gene therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/99d3a9d7-df9a-45dc-922a-4e6a7c6f0e41

　　[6] Nelson et al., (2019). Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy. Nature Medicine, https://doi.org/10.1038/s41591-019-0344-3.

　　[７] SAREPTA 2019 PPMD ANNUAL CONFERENCE PRESENTATION (gene therapy). Retrieved August 19, 2019, from https://investorrelations.sarepta.com/static-files/99d3a9d7-df9a-45dc-922a-4e6a7c6f0e41